一种核素标记的靶向探针化合物及其制备方法与流程

本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一种核素标记的靶向探针化合物及其制备方法。

背景技术：

肝纤维化是由于反复的肝损伤引起的并伴随着细胞外基质(主要为胶原蛋白)的沉积。在受损的肝组织中，细胞外基质蛋白会通过形成纤维瘢痕替代坏死组织，最终导致肝脏结构紊乱和肝功能异常。肝星状细胞的活化和增值在肝纤维化发病机理中起主要作用。活化的肝星状细胞的特征表现为增值加快、过表达α平滑肌肌动蛋白(a-sma)、持续合成细胞外基质蛋白以及分泌趋化因子和促纤维因子。因此，通过对活化的肝星状细胞进行显像是一种良好的评估肝纤维的策略。

有文献报道n-乙酰葡萄糖胺(nag)对细胞表面的波形蛋白和肌间线蛋白有很强的亲和力(glycobiology，2010，20(7)：843-864)。重要的是，活化的肝星状细胞波形蛋白和肌间线蛋白的表达量远高于静息状态的肝星状细胞和其他非实质细胞。波形蛋白和肌间线蛋白都属于iii型中间丝蛋白家族，在维持细胞结构中起重要作用。除了存在于细胞质中，在病理条件下这些蛋白还会被招募到细胞表面。在肝星状细胞活化阶段，波形蛋白和肌间线蛋白的表达会大幅上调。经确认nag可以结合到细胞膜表面的波形蛋白和结蛋白的rodii结构域。在体外培养中，连有nag的聚合物可以结合新鲜分离的肝星状细胞并抑制其活化(biomaterials，2012；33：2154-64)。同时，有专利(cn201510979220.8)公布了o-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰在防治肝纤维化中的应用。此发明通过增强o-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰抑制肝星状细胞过度活化和增殖，抑制肝脏中α-平滑肌肌动蛋白和i型胶原的表达以及纤维间隔的形成。

最近有文献(biomaterials，2013；34：6504-14)报道了一种含有n-乙酰葡萄糖胺结构的复合物用于肝纤维化的荧光成像和治疗。但是，此探针需要非常长肝脏积累的时间，而成像时间慢、荧光信号淬灭快、成像效果差。此外，光学成像穿透深度比较低，无法用于人体肝纤维化检测。

然而，在现有的放射性标记的化合物中，尚未有靶向活化肝星状细胞波形蛋白和肌间线蛋白的探针报道。虽然已有文献(journalofhepatology，2013；58(6)：1119-24)报道一种放射性探针¹⁸f-fdgal，通过pet成像监测肝硬化患者的肝脏代谢功能来评估肝硬化。此放射性示踪剂在评估晚期肝纤维化和肝硬化中有用，但是由于其不能直接反应纤维化的程度，对于早期和中期的纤维化检测并不是很灵敏。另有文献(hepatology，2011；54(3)：1020-30)报道基于rgd多肽的放射性示踪剂通过靶向活化的肝星状细胞表面的整合素受体αvβ3，用于肝纤维化spect成像。作为肝星状细胞靶向的探针，可以反应纤维化程度以及对早期肝纤维化进行检测。但是，此探针在肾脏中有非常高的摄取影响了肝脏成像质量，不利于肝脏摄取的定量分析。同时，高的肾摄取引起的医学内照射剂量也不可忽视。

在上述现有技术中，存在诸多缺陷例如穿透深度低、成像时间慢、成像质量差、对早期纤维化灵敏度低以及肾摄取高等。这些都制约了其在临床中的应用。现有技术中需要一种兼具成像时间快、成像质量高、药代动力学性质适宜以及成像深度不受限等特点的探针化合物以及由其制得的显像剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种核素标记的靶向探针化合物。

本发明的另一目的在于提供上述核素标记的靶向探针化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述核素标记的靶向探针化合物的应用。

本发明的技术方案如下：

一种核素标记的靶向探针化合物，分子量为1kda～50kda，具有聚乙烯亚胺骨架和衍生自n-乙酰葡萄糖胺或二乙酰基壳二糖酸的靶向基团，由放射性核素x标记与聚乙烯亚胺骨架上的亚氨基配位从而实现标记，其具体结构式如下：

其中，x、y、z为整数，x＞0且y、z中至少一个不为0。

在本发明的一个优选实施方案中，所述放射性核素x为^99mtc、¹⁷⁷ru、¹¹¹in、¹⁵⁷gd、⁶⁴cu和^67/68ga中的至少一种。

一种上述靶向探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)壳二糖酸的制备：室温下，1当量壳二糖用1～5当量的体积比1∶3～1∶5的水和甲醇的混合溶液进行溶解，接着加入碘的甲醇溶液混合均匀，上述碘的甲醇溶液为2～5当量的碘溶于10～25当量的甲醇，然后加入2～10wt％koh的甲醇溶液直到碘的颜色消失，进而用2～5当量乙醚进行重结晶12～48h得到壳二糖酸钾，最后将壳二糖酸钾通过离子交换柱获得壳二糖酸；

(2)标记前体nag-pei的制备：将1当量上述壳二糖酸在2～5当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)作为催化剂的情况下与1～5当量聚乙烯亚胺室温反应24～72h，制得标记前体nag-pei；

(3)核素标记的靶向探针化合物的制备：将1当量上述标记前体nag-pei和0.1～0.5当量溶于0.1～0.2mhcl溶液的sncl2混匀，然后每100μg前体nag-pei加入185～370mbq新鲜的放射性核素x前体20～100℃反应20～40分钟后，制得所述的核素标记的靶向探针化合物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述放射性核素x前体为na^99mtco4、¹⁷⁷rucl3、¹¹¹incl3、¹⁵⁷gdcl3、⁶⁴cucl2和^67/68gacl3中的至少一种。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：将1当量上述壳二糖酸溶于含有2～5当量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的四甲基乙二胺(temed)溶液中，然后使其与1～5当量聚乙烯亚胺进行反应24～72h，在室温下搅拌至反应完全，再将反应后得到的物料放入透析袋中进行透析，透析完后将透析袋中的溶液冻干得所述标记前体nag-pei。

上述靶向探针化合物在制备肝星状细胞及相关疾病的显像剂中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明的核素标记的靶向探针化合物可用于体内肝纤维化检测，具有更短的成像时间、更高的成像质量、更广的成像深度以及更少的肾脏放射性积累等优点，更有利于早期肝纤维化的检测。同时，通过联合ct成像可得到精确的解剖学结构信号和功能信息，有利于肝纤维化的评估以及精确分期。

2、本发明的核素标记的靶向探针标记条件温和、标记时间短、标记产率高等特点，无须后续纯化即可使用，更加有利于标记物的商业化应用与临床推广。

3.本发明的核素标记的靶向探针中的多聚体有利于提高比活度，通过spect仪器扫描能够得到高质量的显像结果，能够在体实时动态监测肝纤维化进展及其逆转。

4、本发明的核素标记的靶向探针的制备思路扩展性强，靶向基团可任意替换为其他常用靶向分子，从而获得不同靶向功能的可用于不同核素标记的分子靶向探针。

5、与现有探针相比，本发明的核素标记的靶向探针化合物具有更短的成像时间、更高的成像质量以及更广的成像深度等优点，更利于其在临床中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例1的基本原理图，其中，a为nag-pei的合成路线图，b为^99mtc-nag-pei标记示意图。

图2为本发明实施例2中^99mtc-nag-peispect/ct肝脏区域动态扫描结果图，其中，a为^99mtc-nag-peispect/ct动态扫描肝脏摄取曲线图，b为^99mtc-nag-peispect/ct动态扫描图。

图3为本发明实施例2中^99mtc-nag-peispect/ct全身静态扫描结果图，其中，a为^99mtc-nag-peispect/ct静态扫描图，b为^99mtc-nag-peispect/ct静态扫描肝脏摄取值图，c为spect/ct肝脏摄取与天狼星红染色结果相关性分析图，d为spect/ct肝脏摄取与肝脏羟脯氨酸含量相关性分析图。

图4为本发明实施例3中组织切片及天狼星红染色结果图，其中，a为肝组织切片天狼星红染色图，b为天狼星红染色定量结果图，c为^99mtc-nag-pei肝组织切片放射性自显影图，d为^99mtc-nag-pei肝组织切片放射性自显影定量结果图。

图5为本发明实施例4的实验结果图，其中，a为^99mtc-nag-pei肝纤维化小鼠生物分布图，b为^99mtc-nag-pei正常小鼠生物分布图。

图6是为本发明实施例5中^99mtc-nag-pei细胞摄取及抑制实验曲线图；

图7为本发明实施例5中免疫荧光实验结果图，其中，a为肝组织切片α-sma免疫荧光图，b为肝组织切片desmin免疫荧光图，其中蓝色：dapi、绿色：fitc、红色：cy5.5。

图8为本发明实施例5中，nag-pei肝星状细胞摄取及抑制实验荧光图，其中蓝色：dapi、红色：cy5.5；

图9为本发明实施例6的实验结果图，其中，a为^99mtc-nag-pei治疗响应spect/ct静态扫描图，b为^99mtc-nag-pei肝摄取值定量分析图，c为纤维化肝组织cd68免疫荧光图；蓝色：dapi、绿色：fitc、红色：cy5.5，d为治疗后纤维化肝组织天狼星红染色图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1nag-pei的制备与^99mtc标记

1、nag-pei的合成

室温下，0.1g壳二糖用水和甲醇的混合溶液进行溶解。将0.285g碘溶于4ml甲醇中，与上述的壳二糖溶于混匀。将溶液中加入4％的koh溶液直到碘的颜色消失。将溶液用乙醚进行重结晶得到壳二糖酸钾。产物在通过ir-120离子交换柱获得壳二糖酸[(nag)2-cooh]。壳二糖酸在edc作为催化剂的情况下与pei(分子量：1800)进行连接。简单的说，25％摩尔比的壳二糖酸[(nag)2-cooh]溶于含有edc的temed的溶液中与pei进行反应，室温下搅拌72h。溶液放入透析袋(mwco：2500)中透析3天，冻干得nag-pei。如图1a所示。

2、glcnac-pei的表征

首先，取10mg合成的nag-pei进行了核磁共振氢谱分析，并与pei进行对比。nag-pei的乙酰基在1.81-1.88ppm有特异性吸收峰，nhch2ch2在2.41-2.66ppm有吸收峰。而pei没有1.81-1.88ppm的吸收峰，可以证明材料合成成功。实验完成后将材料回收，重新冻干。然后做了modi-tof-ms质谱分析，测得nag-pei的平均分子量为3300。接下来，采用苯酚-浓硫酸法测定了nag-pei中的糖含量。制作标准曲线：准确称取nag20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，沸水浴显色15min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。通过计算得出glcnac-pei中的糖含量为43.5％。

3、nag-pei的^99mtc标记与鉴定

^99mtc-nag-pei标记如图1b所示。标记过程简单的说，将100μg/100μl的nag-pei和20μlsncl2(2mg/ml溶于0.1mhcl)在青霉素小瓶中混匀。然后将185mbq新鲜的na^99mtco4加入混合液中。室温反应30分钟。然后用薄层层析(tlc)对标记率进行检测，itlc-sg纸条作为固定相，acd溶液(0.068m柠檬酸钠，0.074m葡萄糖，ph5.0)作为流动相。标记物的稳定性也用同样的方法进行检测。然后所有的纸条用miniscan进行检测。同时我们检测了^99mtc-nag-pei在血清和磷酸盐缓冲液(pbs)中的稳定性。简单的说，去少量新鲜标记的^99mtc-nag-pei溶液18～36kbq在血清或pbs溶液中孵育4h(标记物与溶液比值为1∶9)，孵育过后用tlc进行检测，固定相和流动相同上所述。^99mtco4^-的rf值为0.9-1之间，而标记物^99mtc-nag-pei的rf值为0-0.1之间，可以说明标记成功，统计软件分析测得^99mtc-nag-pei标记率大于97％，且在血清和pbs溶液中有良好的稳定性。

实施例2^99mtc-nag-peispect/ct显像评估小鼠肝纤维化

1、肝纤维小鼠模型的构建

实验所用小鼠为雌性c57bl/6小鼠，购于厦门大学实验动物中心。ccl4被用于诱导小鼠的肝纤维化。简单的说，ccl4溶于橄榄油中(1∶4)，c57bl/6的雌性小鼠腹腔注射5ml/kg的ccl4溶液，每周2次。对照组给予相同剂量的橄榄油。每组5只小鼠，分别4周和8周。

2、^99mtc-nag-peispect/ct肝脏区域动态扫描

动态spect/ct扫描小鼠分组为：对照组3只以及8周纤维化组3只。将小鼠先用异氟烷进行麻醉，然后将小鼠置于spect/ct内扫描，全程异氟烷进行麻醉，氧气流速为0.8ml/min，麻醉药气浓度为2％。先进行ct扫描，选定扫描范围，使用滞留针尾静脉注射500μci的^99mtc-nag-pei马上进行spect扫描。ct参数为：能量峰50kv，670μa，480投影，中等变焦；spect参数为：能量峰值为140kev，20个扫描，5s/帧，扫描时间0-50分钟。

为了明确^99mtc-nag-pei在肝脏中摄取随时间的变化我们进行了0-50分钟动态spect/ct的扫描，如图2a所示。通过肝脏放射性摄取曲线可以看出，纤维化组的肝脏放射性摄取值明显高于对照组。纤维化组的摄取在25-30分钟到达峰值，随后趋于稳定，肝摄取50分钟内没有降低；而对照组的肝摄取值远低于纤维化组，肝脏摄取在20分钟左右达峰值，随后肝脏摄取开始降低。图2b为不同时间点的动态扫描图像，从图像中可也可以看出随着时间增加肝脏摄取值随着增加，且肝纤维化组的肝脏摄取值明显高于对照组。

3、^99mtc-nag-peispect/ct全身静态扫描

静态spect/ct扫描小鼠分组情况为：对照组、4周纤维化组以及8周纤维化组，每组4只。spect/ct显像操作：首先，小鼠尾静脉注射18mbq的^99mtc-nag-pei30分钟后将小鼠先用异氟烷进行麻醉，然后将小鼠置于spect/ct内进行扫描，全程异氟烷进行麻醉，氧气流速为0.8ml/min，麻醉药气浓度为2％。先进行ct扫描，然后进行spect扫描。所有操作均安装操作说明进行。ct参数为：能量峰50kv，670μa，480投影，中等变焦；spect参数为：能量峰值为140kev，窗口宽度为20％，矩阵为256×256，中等变焦，30s/帧。

根据spect/ct动态扫描的结果，肝纤维化小鼠肝摄取在35-30分钟达到峰值，因此我们选择尾静脉注射探针30分钟进行全身静态扫描。spect/ct显像图如图3a所示，除了脾脏以及膀胱有较高的摄取外^99mtc-nag-pei在肝脏部位特异性高摄取。随着ccl4诱导时间的增加，肝纤维化小鼠的肝脏摄取值也随之增加。ccl4诱导8周的肝纤维化小鼠的肝脏摄取值明显高于诱导4周的肝纤维化小鼠(468±11.1mbq/mlvs330±16.0，p＜0.01)，远高于对照组小鼠(468±11.1mbq/mlvs234±11.4mbq/ml，p＜0.001)；如图3b所示。同时我们对spect扫描结果与组织学检测指标进行了相关性分析。分析结果表明spect肝脏摄取值与天狼星红染色定量结果之间具有良好的相关性(r＝0.92，图3c)，同时spect肝脏摄取值与肝脏中的羟脯氨酸含量之间也具有良好的相关性(r＝0.87，图3d)。所用小鼠停止给药一周后进行显像，避免ccl4的急性影响。

实施例3纤维化肝组织切片天狼星红染色及放射性自显影

1、组织切片及天狼星红染色

组织包埋：首先，取将显像完的对照组和纤维化组的小鼠引颈处死，取出肝脏，每个肝脏用刀片切两块1.5×1.5厘米近似方形肝组织，要求组织边缘平整，用pbs溶液洗两次，去除血细胞，然后将肝组织放入含有4毫升4％的多聚甲醛溶液的离心管中固定过夜。pbs溶液洗2次后过梯度酒精进行脱水，酒精浓度从50％至100％每次30分钟。如果有事情需要中断实验，可以在70％酒精这一步放入4℃过夜。脱水完后用二甲苯进行透明，酒精：二甲苯1∶1混合液透明30分钟，然后在二甲苯中透明2次，每次40分钟。透明时注意观察透明的情况，组织血管是否清楚，组织透明是否彻底，可根据组织实际情况增加或减少透明时间。透明完后组织浸蜡，二甲苯/石蜡(1∶1)混合液中浸蜡30分钟，然后在液体石蜡中浸蜡两次，每次1h。浸蜡过程在67℃烘箱里面进行，石蜡需要提前放入烘箱融化。最后，将组织放入包埋盒里面，倒入液体石蜡进行包埋。让包埋好的蜡块室温凝固过夜。

组织切片：将包埋好的蜡块固定在石蜡切片机上，先将切片厚度调至20μm进行修片。当蜡块暴露出组织后，见切片厚度调至5μm进行连续切片，每个组织块切20张片子，切好的片子放入37℃水浴锅里面进行展片，然后用载玻片捞片，做好标记，放入标本架上，放入37℃烘箱烘片2h。最后将组织切片放入标本盒保存。

天狼星红染色：首先，将组织切片在二甲苯中脱蜡两次，每次5分钟。然后过梯度酒精，浓度100％至50％每次2分钟，最后放入蒸馏水2分钟。接下来用0.5％天狼星红苦味酸溶液染色15-30分钟，水洗至无色，如果需要染核，1％盐酸酒精分色7秒，自来水冲洗5分钟，然后用苏木素复染2分钟，水洗至无色。接下来过梯度酒精脱水，50％至100％每次1分钟，然后二甲苯透明2次，每次5分钟，最后将组织切片用中性树脂进行固封。镜下观察，拍片，然后将组织切片放入标本盒保存。

天狼猩红染色的结果可以看出随着ccl4诱导时间的增加，胶原纤维的面积逐渐增多。对照组的小鼠肝脏中胶原纤维只是存在于汇管区，当ccl4诱导4周，胶原纤维从汇管区延小叶边界延伸，形成短小的胶原瘢痕，纤维化发展到中期，当ccl4诱导8周后，胶原瘢痕逐渐桥联在一起，形成小叶间隔，纤维化发展到晚期；如图4a所示。然后我们使用软件对天狼星红的面积进行了定量，ccl4诱导8周组天狼星红面积要高于ccl4诱导4周组，明显高于对照组(对照vs4w纤维化＝1.04±0.12vs2.26±0.15，p＜0.05；对照vs8w纤维化＝1.04±0.12vs3.24±0.28，p＜0.01)，如图4b所示。

2、^99mtc-nag-pei肝组织放射性自显影

首先将肝组织切片，在二甲苯中脱蜡，5分钟2次，然后过梯度酒精，浓度从100％到50％，每次2分钟，然后蒸馏水总浸泡2分钟。接下来将组织加入18kbq^99mtc-nag-pei孵育15分钟，然后pbs溶液洗三次，每次5分钟。将组织放入储磷屏中暗盒里曝光1h，然后将曝光后的储磷屏在成像仪中进行扫描，结果如图4c所示。纤维化组的放射性摄取值明显高于对照组，如图4d(对照组放射性摄取值vs纤维化组放射性摄取值＝3724±512vs1754±419，p＜0.05)。

实施例4^99mtc-nag-pei小鼠生物分布实验

1、^99mtc-nag-pei肝纤维化小鼠生物分布实验

肝纤维化模型构建同实施例2，每只小鼠注射37kbq的^99mtc-nag-pei，1h后，将小鼠断颈处死，然后去其脏器(包括：心、肝、脾、肺、肾、肠、肌肉、胃)进行称重，γ计数器测定各个脏器的放射性计数。生物分布结果表明，随ccl4诱导时间的增加^99mtc-nag-pei在肝脏的摄取随着增加(对照组vs4w纤维化＝2.54±0.401vs4.904±0.579；p＜0.01对照组vs8w纤维化＝2.54±0.401vs7.74±0.764；p＜0.01)，另外^99mtc-nag-pei在脾脏中有较高的摄取，而其他脏器的摄取值都很低；如图5a所示。

2、^99mtc-nag-pei正常小鼠生物分布实验

正常8周龄的balb/c小鼠购于厦门大学实验动物中心，被用于生物分布实验研究。每只小鼠注射37kbq的^99mtc-nag-pei，30分钟、1h和2h之后，将小鼠断颈处死，然后去其脏器(包括：心、肝、脾、肺、肾、肠、肌肉、胃)进行称重，γ计数器测定各个脏器的放射性计数。生物分布结果表明，正常小鼠中^99mtc-nag-pei在脾脏中有较高的摄取，而其他脏器的摄取值都很低，随着时间的增加，^99mtc-nag-pei在脾脏中的摄取降低；如图5b所示。

实施例5^99mtc-nag-pei肝星状细胞特异性实验

1、竞争性细胞结合实验

从纤维化小鼠的肝组织中分离肝星状细胞，在37℃co2细胞培养箱进行扩增。接下来将扩增的细胞消化，接种的24孔板，每孔接种10⁵细胞。24h后，将细胞用bindingbuffer(pbs+0.5％bsa)洗2次，实验组加入1.8kbq^99mtc-pei-nag，抑制组加入1.8kbq^99mtc-pei-nag和500μmolnag-pei，37℃孵育15、30、60、90、120、180、240分钟。孵育完之后，细胞用bindingbuffer洗2次，然后用1n的naoh溶解，收集到液体。γ-counter测放射性计数。

竞争性细胞结合实验结果表明，^99mtc-pei-nag在细胞中的摄取值随着时间的增加而增加，当加入冷配体pei-nag进行抑制后，^99mtc-pei-nag在细胞中的摄取值明显降低；如图6所示。

2、免疫荧光实验

取对照组和纤维化组小鼠的肝脏组织用组织包埋剂包埋，冻于-80℃冰箱。24h后将组织块用冰冻切片机切成7μm切片。肝组织切片用4％对聚甲醛固定10分钟，然后用5％的bsa封闭0.5h，pbs洗三次，然后加入1∶50desmin(靶向蛋白)或1∶200α-sma(活化肝星状细胞表面标志物)的单克隆抗体4％孵育过夜。第二天将切片拿到室温，pbs洗三次；然后用fitc荧光二抗和连有cy5.5的nag-pei孵育30分钟，pbs洗三次。接下来用dapi染核10分钟，pbs洗3次，50％甘油封片。将组织切片在共聚焦显微镜下观察。

如图7a所示，纤维化组α-sma(活化的肝星状细胞表面标志物)表达以及nag-pei-cy5.5摄取明显高于对照组肝组织，同时α-sma与nag-pei-cy5.5有明显的共定位(箭头所指的位置)。同样，desmin在纤维化肝组织中表达远高于对照组，并且desmin与nag-pei-cy5.5有明显的共定位，如图7b所示。以上结果可以表明，nag-pei可以特异性的靶向活化肝星状细胞表面的desmin。

3、nag-pei肝星状细胞摄取抑制实验

将肝星状细胞(2×10⁶/孔)接种到培养板(6孔板，每个孔底部一个灭过菌的盖玻片，用于细胞爬片)，培养24h，镜下观察等细胞成长到密度80％左右时，小心吸出所有培养基，洗去表面死去或脱落的细胞，然后向每个孔板中加入0.5ml新的培养基。这时将孔板举起，透过光线从底部观察，可看见孔板底部有一层均匀的细胞膜，以均匀且没有明显脱落的区域为好。将6孔板按实验需要分好区域，在板盖表面上做好记号，实验分为两组，每组三个重复。首先向抑制组孔板中加入100μlnag溶液(1mg/ml)孵育30min，然后取1～3μlnag-pei-cy5.5(1μg/μl)加入培养基(总体积500μl)中，加盖在37℃孵育30min。培养结束后，将孔板中所有的培养基完全吸出，然后向其中的抑制组和对照组孔板中加入0.5ml冰冷的pbs(含0.2％bsa)洗两次，dapi染核10分钟，pbs洗3次，将培养板中的盖玻片取出，贴在载玻片上，50％甘油封片。将载波片在共聚焦显微镜下观察。实验结果如图8所示，加入nag抑制之后，肝星状细胞对靶向探针nag-pei的摄取有明显减少，进一步证明了靶向探针nag-pei的特异性。

实施例6^99mtc-nag-pei监视肝纤维的治疗响应

缺少非侵入式的监视肝纤维化进程的方法限制的抗纤维化药物的开发。因此评估本发明^99mtc-nag-pei能否监视肝纤维的治疗响应。氯磷酸盐脂质体(sigmaaldrich，usa)被用于小鼠肝纤维化的治疗。之所以用氯磷酸盐脂质体治疗肝纤维化是因为氯磷酸盐脂质体可杀死肝组织中的巨噬细胞。根据文献报道，巨噬细胞能够产生促纤维化因子(例如转化生长因子tgf-β1、血小板样生长因子pdgf)，通过调节金属蛋白酶mmp和金属蛋白酶组织抑制剂的表达控制ecm沉积的反转。ccl4诱导8周的纤维化小鼠尾静脉注射5ml/kg的氯磷酸盐脂质体，每周一次持续2周。对照组给予相同剂量的pbs脂质体。每组5只小鼠。^99mtc-nag-peispect/ct静态扫描表明，氯磷酸盐处理后纤维化小鼠肝脏的放射性摄取明显降低，氯磷酸盐处理组vs对照组231.7±17.6vs356.7±20.7mbq/ml(spect/ct静态扫描操作同实施例2)，如图9a、b所示。免疫荧光结果显示的氯磷酸盐处理后纤维化肝组织中cd68的表达以及nag-pei摄取都有明显降低(免疫荧光操作同实施例5)，如图9c所示。同时肝组织切片天狼猩红染色结果表明，经过氯磷酸盐处理后纤维化肝组织中的胶原纤维的量明显减少(天狼猩红染色操作同实施例4)，如图9d所示。

目前临床是用于检测肝纤维化的金标准还是活检，是一种侵入式的手段常伴随着疼痛和出血。传统影像学如超声、ct和mri主要通过检测形态的改变，但发生以上改变时疾病往往已经发展到肝硬化阶段，其对于早期纤维化的诊断缺乏灵敏性。^99mtc-nag-pei作为一种分子靶向探针可以可靠的区分正常肝脏和早期纤维化，可以用于早期纤维化诊断；同时可以用于抗纤维化药物的疗效检测。

肝星状细胞的活化和增值在肝纤维化发病机理中起主要作用，通过对活化的肝星状细胞进行显像是一种良好的评估肝纤维的策略。^99mtc-nag-pei对活化的肝星状细胞表面的波形蛋白和肌间线蛋白有很强的亲和力，能够用于早期肝纤维化的诊断及治疗响应的监测。本核素标记的靶向探针化合物具有标记能力强、标记时间短、标记产率高等特点，无须后续纯化即可使用，更加有利于标记物的商业化应用与临床推广。

本领域普通技术人员可知，本发明的技术方案在下述范围内变化时，仍然能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍然属于本发明的保护范围：

一种核素标记的靶向探针化合物，分子量为1kda～50kda，具有聚乙烯亚胺骨架和衍生自n-乙酰葡萄糖胺或二乙酰基壳二糖酸的靶向基团，由放射性核素x标记与聚乙烯亚胺骨架上的亚氨基配位从而实现标记，其具体结构式如下：

其中，x、y、z为整数，x＞0且y、z中至少一个不为0。

所述放射性核素x为^99mtc、¹⁷⁷ru、¹¹¹in、¹⁵⁷gd、⁶⁴cu和^67/68ga中的至少一种。

上述靶向探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)壳二糖酸的制备：室温下，1当量壳二糖用1～5当量的体积比1∶3～1∶5的水和甲醇的混合溶液进行溶解，接着加入碘的甲醇溶液混合均匀，上述碘的甲醇溶液为2～5当量的碘溶于10～25当量的甲醇，然后加入2～10wt％koh的甲醇溶液直到碘的颜色消失，进而用2～5当量乙醚进行重结晶12～48h得到壳二糖酸钾，最后将壳二糖酸钾通过离子交换柱获得壳二糖酸；

(2)标记前体nag-pei的制备：将1当量上述壳二糖酸在2～5当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作为催化剂的情况下与1～5当量聚乙烯亚胺室温反应24～72h，制得标记前体nag-pei；优选的，该步骤为：将1当量上述壳二糖酸溶于含有2～5当量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的四甲基乙二胺溶液中，然后使其与1～5当量聚乙烯亚胺进行反应24～72h，在室温下搅拌至反应完全，再将反应后得到的物料放入透析袋中进行透析，透析完后将透析袋中的溶液冻干得所述标记前体nag-pei；

(3)核素标记的靶向探针化合物的制备：将1当量上述标记前体nag-pei和0.1～0.5当量溶于0.1～0.2mhcl溶液的sncl2混匀，然后每100μg前体nag-pei加入185～370mbq新鲜的放射性核素x前体20～100℃反应20～40分钟后，制得所述的核素标记的靶向探针化合物；上述放射性核素x前体为na^99mtco4、¹⁷⁷rucl3、¹¹¹incl3、¹⁵⁷gdcl3、⁶⁴cucl2和^67/68gacl3中的至少一种。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容。