一种水稻稻米香味基因的SNP功能分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用。

背景技术：

传统系谱法选育是水稻育种家们普遍采用的方法，通过育种家们的多年努力，培育和创制了大量高产、高抗和优质的水稻新品种。然而，结合表型鉴定的传统育种模式存在表型把控不准、遗传群体需求量大、人力成本高、育种周期长等缺陷，很难实现大规模商业化集成育种或材料遗传改良。伴随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助选择育种(molecularassistedselectoin，mas)显现了巨大的技术优势，实现了遗传基础与目标性状的结合，选择含有目标基因的材料(单株)进行组配，实现了目标性状的精准改良，能有效回避传统育种方法的技术壁垒。

单个核苷酸变异(singlenucleotidepolymorphism，snp)在物种的基因组上广泛存在，包括：单个碱基的转换或颠换、单个碱基(片段)插入或缺失等形式，针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的snp分子标记技术。针对控制目标性状的基因开发功能snp标记，将性状与基因型相关联进而实现高效、精准育种。现阶段，适用于snp检测的手段主要有凝胶电泳和荧光定量pcr，但但检测过程需要酶切、电泳及测序等，操作复杂，而且pcr产物的气溶胶和eb对人体的危害，对环境的污染。竞争性等位基因pcr(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。

针对水稻稻米香味控制基因研究人员分离和克隆了badh2基因。该基因编码甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenasea)，能抑制水稻香米主要成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2-ap)的生物合成，当badh2基因功能缺失时，稻米中能积累2-ap，使水稻稻米具有香味。目前，香米受到广大消费者的青睐并体现出了巨大的商业前景，育种家们也致力于香稻品种的培育和材料遗传改良工作，目前主要育成品种包括：basmati系列、泰国香米系列、宜香系列和玉针香系列品种等。但在香稻育种工作中，香稻的表型鉴定需要籽粒成熟后才能进行收种鉴定；同时，该基因为一个功能缺失型变异，在杂交配组过程中杂合型表现为非香味表型或香味较淡，推测该性状主要有胚和胚乳的基因型决定而并非由植株决定。这些因素都极大了限制了水稻稻米香味品质性状的育种和遗传改良进度，而且费时费力。因此，开发出适用于苗期高通量鉴定植株基因型的功能snp分子标记，助力大规模商业化分子育种具有广泛的应用前景和经济价值。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种水稻稻米香味基因的snp分子标记，解决现有香稻稻香的表型鉴定育种周期长、育种成本高和育种效率低等问题。本发明还提供了用于检测snp功能分子标记的引物组和kasp方法，解决了实验操作不安全、操作复杂和人工鉴定结果不准确等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记，其特征在于，所述香味基因为badh2，基因内部的第二号外显子区域存在7bp碱基的插入缺失，所述的snp功能分子标记为k_08gbadh2-1，位于水稻第8号染色体第20380271位碱基处，该snp功能分子标记多态性为g/c，其序列如seqidno.1，相比野生型(非香味材料)基因序列该序列51bp处存在7bp缺失即“gcgccgg”。

根据文献资料显示，badh2基因位于水稻8号染色体上物理位置：20379794-20386061区间内。当基因外显子区间发生移码突变，基因功能丧失，水稻稻米产生香味。针对香稻和非香稻材料见的变异位点，我们发现在基因的第二号外显子区间存在一个突变位点，该位点存在7bp碱基的缺失，提取该位点左右两侧各50bp序列，利用batchprimer3进行引物设计，得到用于检测snp功能分子标记的引物组包括特异性引物specific-allelex和specific-alleley，通用引物primercommon，specific-allelex为香味基因型特异引物，specific-alleley为非香味基因型特异引物。

其中特异性引物序列为：

specific-allelex：tacttggcccggacggcgcg

specific-alleley：tacttggcccggacggcgcc

通用引物序列为：

primercommon：gaggcgctgaagaggaaccg

进一步，含有上述引物组的试剂或试剂盒，用于鉴定水稻香味、水稻种质资源改良或水稻育种。

进一步，水稻稻米香味基因的snp功能分子标记的应用，包括如下步骤：

1)基因组提取：采用简化ctab法，从水稻叶片中提取基因组dna，首先将水稻叶片冻干或烘干，取适量叶片放入2.0ml离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；再加入750μlctab溶液，震荡匀浆，65℃震荡温浴0.5-1h；冷却至室温，在通风橱中加入750μl氯仿︰异戊醇(24︰1)颠倒3-4次混匀；12000rmp离心10min，取上清500μl转移至新的1.5ml离心管中；加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，弃上清；加入1ml70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；加300μlh2o，溶解备用；

2)kasp反应：以步骤1)获得的水稻基因组dna为模板，利用荧光特异性引物进行pcr反应，所述荧光特异性引物的正向引物为特异性引物的5’端分别连接不同荧光标签序列，反向引物为通用引物；

其中荧光标签序列为：

fam-tail:gaaggtgaccaagttcatgct

vic-tail:gaaggtcggagtcaacggatt

正向引物序列为：

primerx：gaaggtgaccaagttcatgcttacttggcccggacggcgcg

primery：gaaggtcggagtcaacggatttacttggcccggacggcgcc

3)荧光检测：若只检测到引物specific-allelex所连荧光序列对应的荧光信号，则测试水稻为香味水稻样品，若只检测到引物specific-alleley所连荧光序列对应的荧光信号，则判定测试水稻为非香味水稻样品，若同时检测到两种荧光，则判断测试水稻为香味和非香味的杂合样品。

进一步，在水稻稻米香味基因的snp功能分子标记的应用中，pcr扩增反应体系如表1

表1

pcr扩增反应条件如表2：

表2

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供了一种用于检测水稻香味基因badh2第二外显子变异的功能分子标记，其为一种常用香稻基因型变异类型。该标记位于badh2基因内部，基因型数据与表型数据紧密关联，该方法适用于水稻苗期高通量的badh2基因的鉴定及辅助选择育种，加快了水稻香味品质性状的遗传改良。参照标记检测基因型数据，无需进行耗时费力的表型鉴定流程，大幅减少了育种的工作量，育种效率高，成本低。对促进badh2基因商业化分子育种的应用具有重要意义。

2、本发明应用kasp技术对所寻找到的snp分子标记进行基因型分型，可以快速、精确的检测badh2-e2基因型，大幅提高基因转育的效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，操作简便，利于高通量快速检测，彻底杜绝了pcr产物的气溶胶污染和eb对环境的污染、甲醛对人体的危害。

3、本发明提供的badh2基因为一个功能缺失型变异，变异位点的移码突变使badh2基因失去功能，不能催化2-乙酰基-1-吡咯啉的氧化，使水稻稻米产生香味。关于该基因的变异位点不止发明中提到的位点，但该位点与常用育种材料和部分香稻商业品种基因型一致。所以本发明snp功能分子标记适用范围广。

附图说明

图1为利用分子标记k_08gbadh2-1检测自然群体基因型分型图；

图2为利用分子标记k_08gbadh2-1检测轮回亲本、骨干亲本及基因供体材料基因型分型图；

图3为利用分子标记k_08gbadh2-1检测f2分离群体。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1分子标记k_08gbadh2-1在检测自然遗传材料基因型的应用

选取46份自然遗传材料进行验证，包括30份香稻和16份非香稻材料。

1、采用简化ctab法，从水稻叶片中提取基因组dna。

(1)将水稻叶片冻干或烘干，取适量叶片放入2.0ml离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；

(2)加入750μlctab溶液，震荡匀浆，65℃震荡温浴0.5-1h；

(3)冷却至室温，在通风橱中加入750μl氯仿︰异戊醇(24︰1)颠倒3-4次混匀；

(4)12000rmp离心10min，取上清500μl转移至新的1.5ml离心管中；

(5)加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，弃上清；

(6)加入1ml70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；

(7)加300μlh2o，溶解备用。

2、kasp反应测试

kasp反应测试在lgcsnpline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入步骤1获得的水稻基因组dna样品(20ng/μl)1.0-1.5μl，烘干后加入kasp反应混合液中，反应体系见表1；pcr扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件见表2；反应完成后利用扫描仪pherastar对kasp反应产物进行荧光数据读取，由于specific-allelex与荧光序列fam相连，specific-alleley与荧光序列vic相连，若只检测到荧光序列vic对应的荧光信号，则测试材料的badh2基因在标记k_08gbadh2-1测试位点碱基型为c，判定其为非香味材料或不属于此种基因型变异的材料，若只检测到荧光序列fam对应的荧光信号，则测试材料的badh2基因在标记k_08gbadh2-1测试位点碱基型为g，判定其为香味材料，若同时检测到两种荧光，则判断测试材料为携带该基因型的杂合型。其中荧光扫描仪器能自动识别fam和vic对应的荧光信号，并将不同的荧光信号自动转化形成图像，如图1所示。46份测试材料标记分型具体结果见表4。

本发明中使用的lgcsnpline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国lgc公司。

表446份自然遗传材料标记k_08gbadh2-1测试结果

由表4可以看出，所检测46份材料中，含30份香稻，16份非香稻，其中非香稻品种(材料)的badh2基因在标记k_08gbadh2-1测试位点碱基型为c；10份香稻品种(材料)的badh2基因在标记k_08gbadh2-1测试位点碱基型为g；20份香稻材料碱基型为c，经测试上述20份香稻材料为badh2基因其他位点的变异，引起基因移码突变而导致的移码突变，我们针对该位点也开发了标记。初步确定了该基因型的snp标记与表型具有高度关联性。

实施例2分子标记k_08gbadh2-1在检测轮回亲本、骨干亲本及基因供体材料基因型的应用

利用标记k_08gbadh2-1对95份重要轮回亲本、骨干亲本及重要基因供体材料进行检测。方法同实施例1。

结果仅3份材料为标记k_08gbadh2-1基因型香味材料(图2)，大部分轮回亲本、骨干亲本及重要基因供体材料不具有该基因型，进一步说明了该基因型材料具有较大的应用前景和范围。从自然遗传群体中筛选该基因型变异的材料做亲本，从而将基因导入到不含该目的基因的材料，实现重要轮回亲本、骨干亲本及重要基因供体材料的遗传改良，为香稻品种的培育提供重要技术支撑。

实施例3分子标记k_08gbadh2-1的分离群体表型验证

1、检测供体亲本武香粳与受体材料nipponbare杂交的f2分离群体单株基因型；方法同实施例1。

2、在水稻成熟期收取纯合基因型单株种子并晒干，用砻谷机打米，获得糙米样品备用；

3、取2g糙米样品，放在50ml离心管中，加入10ml1.7％koh溶液，盖紧盖子，浸泡10min左右，期间颠倒混匀几次；

4、将离心管盖子打开，用鼻子轻轻嗅样品是否有香味散发出，实验对照包括双亲亲本材料、标准香味品种紫香糯和非香味品种广陆矮4号；

5、至少需3名嗅觉灵敏的人员同时进行测试，分别记录自己的判定结果，汇总三人的测试结果，对有不同意见的样品进行重复实验或找第四人进行鉴定。

92份测试材料荧光扫描的结果如图3所示，标记分型具体结果见表5。

表5武香粳×nipponbaref2分离群标记k_08gbadh2-1测试及表型验证

注：“+”表示表型鉴定有香味；“-”表示表型鉴定无香味。

由表5可以看出，f2分离群体单株表型鉴定结果与基因型分型结果高度对应，g碱基型纯合单株具有香味，c碱基型纯合单株无香味，再次验证了本发明的可行性和准确性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

sequencelisting

<110>长江师范学院；

<120>一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用

<160>8

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

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gaaggtgaccaagttcatgcttacttggcccggacggcgcg41

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