一种基于萘酰亚胺的增强型荧光探针、其制备方法及应用与流程

本发明属于化工领域，涉及一种荧光探针，具体来说，涉及一种荧光探针及其制备方法和在检测三价铁离子方面的应用。

背景技术：

铁离子因其可能造成严重的呕吐、腹痛和心脏、肝脏损伤故成为最重要的检测对象之一。

如果细胞的铁稳态受到影响，其氧化还原活性形式会催化产生高活性氧物质以引发对生物大分子和代谢物的损害。根据epa(美国环境保护署)颁布的饮用水标准，规定了铁离子限量0.3mgl^-1的次要标准。因此，准确检测饮用水中fe³⁺离子的含量是必要和重要的。

一些分析方法，如电感耦合等离子体质谱(icp-ms)火焰原子吸收光谱(faas)，等等，可以实现检测铁离子。然而，这些技术通常需要耗时的样品预处理程序和复杂的仪器。

与上述技术相比，用于特定目标的具有荧光开关信号的分子探针提供更有效，更方便，更高的灵敏度和更小的破坏性。通常“淬灭”型探针比“开启”型探针的灵敏度低。与“淬灭”型探针相比，荧光“开启”探头是检测环境中fe³⁺离子的理想测量工具。

然而，许多现有的fe³⁺离子探针由于fe³⁺的顺磁性质而基于荧光淬灭机制。目前，仅有几种“开启式”探针已被报道用于选择性检测fe³⁺离子。此外，大多数用于fe³⁺离子检测的“开启”探针是溶液型的，并且在水中的溶解性差——疏水性大大限制了其应用。

因此，有必要在水溶液中设计具有高灵敏度和选择性的测量fe³⁺离子的“开启”传感器。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中对fe³⁺检测耗时长、不方便及灵敏度低的缺陷，提供一种新的开启型荧光探针，该荧光探针可方便地定量定性检测fe³⁺，灵敏度高，且合成路线简便，成本低。

为了达到上述目的，本发明提供了一种基于萘酰亚胺的增强型荧光探针，该荧光探针具有如下通式：

其中，r为c1～c9烷基中的任意一种。

较佳地，r为正丁基。

本发明还提供了一种根据上述的基于萘酰亚胺的增强型荧光探针的制备方法，该荧光探针的合成路线如下：

，

其包含以下步骤：

步骤1，以n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-溴、哌嗪为原料，反应制备n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪；

步骤2，n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪与2,6-二氯甲基吡啶反应，制备n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪-2,6-双(氯甲基)吡啶；

步骤3，n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪-2,6-双(氯甲基)吡啶与对苯甲醛-哌嗪反应制备荧光探针。

较佳地，步骤1中，1,8-萘酰亚胺-4-溴(v)与哌嗪的摩尔比为(2.8-3.2)：(5.8-6.2)，回流反应8-10小时。

较佳地，步骤2中，n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪(iii)与2,6-二氯甲基吡啶的摩尔比为(0.4-0.5)：(0.18-0.22)，回流反应10-12小时。

较佳地，步骤3中，n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪-2,6-双(氯甲基)吡啶与对苯甲醛-哌嗪的摩尔比为(0.40-0.44)：(0.44-0.48)，回流反应6-8小时。

本发明还提供了一种根据上述的基于萘酰亚胺的增强型荧光探针的用途，该荧光探针用于检测fe³⁺离子的含量。

较佳地，十六烷基三甲基溴化铵作为表面活性剂，帮助荧光探针溶解于水溶液中，用于检测fe³⁺离子的检测限为8.05×10^-7m。

较佳地，该荧光探针能定量检测fe³⁺离子的含量。

较佳地，该荧光探针用于检测水体、土壤中的fe³⁺离子的含量。

本发明的荧光探针在检测溶液中fe³⁺离子的过程中，若溶液中含有fe³⁺离子，通式ⅰ表示的化合物与fe³⁺离子反应后生成的具有通式ⅱ结构的化合物，

从而导致荧光强度的改变，通过测定反应引起的体系中荧光强度的变化获得fe³⁺离子的浓度。本发明的荧光探针检测到fe³⁺离子荧光增强的机理为“光诱导分子内电子转移机理”，称为“pet(photoinducedelectrontransfer的简称)机理”，通式i发生分子内电子转移(发生pet)，荧光发生“淬灭”；通式ii结合fe³⁺离子后pet过程被阻断，荧光增强。

本发明的荧光探针，可对fe³⁺离子进行定性或定量检测。将本发明的萘酰亚胺基探针封装到十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide，ctab)作为水溶性表面活性剂胶束中，增加探针在纯水溶液中的相容性，用于在水溶液感测fe³⁺离子。将fe³⁺离子浓度呈梯度变化的水溶液分别加入萘酰亚胺基探针-ctab的水溶液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度，然后以fe³⁺离子浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强度从图中读出待测溶液中fe³⁺离子的含量。

本发明的荧光探针可以在水溶液中高选择性的与fe³⁺离子作用，在fe³⁺离子存在下使得水溶液中荧光强度发生明显增加，即可根据荧光变化检测水体中是否存在fe³⁺离子，对于环境保护具有重要意义。

相对于现有的检测fe³⁺离子的荧光探针而言，本发明所提供的含萘酰亚胺基荧光探针具有合成比较简单、合成步骤较少、而且原料成本低廉和易于大规模的商业化生产等优点，对fe³⁺离子的检测具有高选择性和高灵敏性，还能实现定量检测，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明提供的荧光探针检测fe³⁺离子的原理示意图。

图2是本发明合成荧光探针naptp高分辨率质谱。

图3是本发明合成荧光探针naptp核磁共振氢谱。

图4是本发明合成荧光探针naptp核磁共振碳谱。

图5是实施例2中，10μmol·l^-1荧光探针naptp在加入不同浓度fe³⁺离子后荧光发射光谱图，从下往上，fe³⁺离子浓度依次为2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90μmol·l^-1，溶液的体系为含有2mmol·l^-1ctab的水溶液，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度值。

图6是实施例2中，fe³⁺离子的浓度的标准曲线图，即10μmol·l^-1荧光探针naptp，反应后在535nm处荧光强度数值与fe³⁺离子浓度(2-90μmol·l^-1)的线性关系；横坐标为fe³⁺离子浓度，纵坐标为荧光探针在535nm处荧光强度数值。

图7是实施例3中，10μmol·l^-1荧光探针naptp加入了50当量的不同金属离子(以水溶液的形式)后的荧光发射光谱图，测试的金属来自ba²⁺，co²⁺，cu²⁺，zn²⁺，fe²⁺，ag⁺，ni²⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，cr³⁺，k⁺，mn²⁺和na+的相应化合物，溶液的体系为含有2mmol·l^-1ctab的水溶液，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度值。

图8是实施例3中，10μmol·l^-1荧光探针naptp对fe³⁺离子的选择性示意图：10μmol·l^-1荧光探针naptp加入了50当量的不同金属离子(以水溶液的形式)后的荧光发射光谱强度柱形图，测试的金属来自ba²⁺，co²⁺，cu²⁺，zn²⁺，fe²⁺，ag⁺，ni²⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，cr³⁺，k⁺，mn²⁺和na+的相应化合物，溶液的体系为含有2mmol·l^-1ctab的水溶液，纵坐标为535nm处荧光强度。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

本发明提供的荧光探针具有如下通式：

其中，r取c1～c9烷基中的任意一种。

本发明的荧光探针的检测fe³⁺离子的原理如图1所示，若溶液中含有fe³⁺离子，通式ⅰ表示的化合物(本发明的荧光探针)与fe³⁺离子反应后生成的具有通式ⅱ结构的化合物。

本发明的荧光探针的合成路线如下：

步骤1，在氮气气氛下，n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-溴(v)与哌嗪在乙二醇单甲醚中回流反应8-10小时，除去乙二醇单甲醚后，残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用氯仿/甲醇(3:1，v/v)作为洗脱剂，得到n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪(ⅲ)；其中，所述的n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-溴(v)、哌嗪及乙二醇单甲醚的摩尔体积比为2.8～3.2mmol：5.8～6.2mmol：15～20ml；

步骤2，将n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪(ⅲ)溶于乙腈中，加入2,6-二氯甲基吡啶，然后在氮气气氛下搅拌回流10-12小时后，将混合物冷却至室温，减压蒸馏后得到黄色固体，将其用二氯甲烷/乙酸乙酯(5:1，v/v)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化，得到n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪-2,6-双(氯甲基)吡啶(ⅳ)；所述的n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪(ⅲ)、乙腈及2,6-二氯甲基吡啶的摩尔体积比为0.4～0.5mmol：45～55ml：0.18～0.22mmol；

步骤3，将n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪-2,6-双(氯甲基)吡啶(ⅳ)、对苯甲醛-哌嗪和乙腈置于烧瓶中，将混合物回流6-8小时。冷却至室温后，减压蒸馏得到粘稠液体。以二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺(二氯甲烷/乙酸乙酯＝5/1并加入0.5％三乙胺，均以体积比计)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化，得到相应的荧光探针(ⅰ)；所述的n-烷基取代的1,8-萘酰亚胺-4-哌嗪-2,6-双(氯甲基)吡啶(ⅳ)、对苯甲醛-哌嗪及乙腈的摩尔体积比为0.40～0.44mmol：0.44～0.48mmol：18～22ml。

下面，以r取正丁基为例具体说明本发明的探针的制备方法及应用。

下列实施例中所说的室温是：25-28℃；所用原料及试剂均为市售品。

实施例1(探针naptp的合成)：

在氮气气氛下，ⅴ-1(1.0g，3.0mmol)与哌嗪(0.52g，6.0mmol)在乙二醇单甲醚(15ml)中回流反应8小时，除去乙二醇单甲醚后，残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用氯仿/甲醇(3:1，v/v)作为洗脱剂，得到ⅲ-1，产率：0.4g(54％)。

将ⅲ-1(163mg，0.44mmol)溶于乙腈(50ml)中，加入2,6-二氯甲基吡啶(35.2mg，0.20mmol)，然后在氮气气氛下搅拌回流10小时后，将混合物冷却至室温，减压蒸馏后得到黄色固体，将其用二氯甲烷/乙酸乙酯＝5:1，(v/v)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化，得到ⅳ-1，产率：138mg(82.0％)。

将200mg(0.42mmol)化合物ⅳ-1，87mg(0.46mmol)对苯甲醛-哌嗪和20ml乙腈置于50ml烧瓶中，将混合物回流6小时。冷却至室温后，减压蒸馏得到粘稠液体。以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5：1并加入0.5％三乙胺，经过硅胶提纯，得到黄色粉末状的化合物naptp(161mg，61％)。

hrms(esi)计算值c38h42n6o3:631.3397；found:631.3408.[m+h]+，如图2所示。

¹hnmr(cdcl3,400mhz)δppm:9.80(brs,1h),8.61-8.59(d,1h),8.54-8.52(d,1h),8.44-8.42(d,1h),7.78-7.70(m,4h,ph),7.45-7.40(m,2h,ph),7.25-7.23(d,1h),6.94-6.92(m,2h,ph),4.21-4.17(t,j＝7.60hz,2h,-ch2ch2ch2ch3),3.87(s,2h,-ch2),3.79(s,2h,-ch2),3.48-3.45(t,j＝4.40hz,4h),3.35(m,4h),2.89(m,4h),2.72(m,4h),1.75-1.73(m,2h),1.49-1.44(q,j＝7.60hz,2h),1.01-0.97(t,j＝7.20hz,3h)；如图3所示。

¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δppm:190.33,164.46,164.01,157.90,157.73,155.90,155.05,136.95,131.81,131.02,130.19,129.88,127.18,126.18,125.59,123.36,121.58,116.84,114.91,113.52,64.37,53.39,53.03,52.88,47.13,40.07,30.26,29.67,20.38,13.83；如图4所示。

实施例2(探针naptp荧光检测fe³⁺离子)

将10μmol·l^-1萘酰亚胺基探针(naptp)加入含有0.2mmol·l^-1十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的纯水溶液中，加入fe³⁺离子，fe³⁺离子浓度依次为2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90μmol·l^-1，激发波长为390nm，在fe³⁺与naptp-ctab混合三秒钟后立即发生荧光增加，荧光光谱如图5所示，随着fe³⁺的不断增加，荧光强度也不断增加。相对于fe³⁺离子的浓度，naptp-ctab的荧光强度增加是线性的。

反应达到平衡后，以390nm为激发波长，分别测定各样品在535nm处的荧光强度，然后以fe³⁺离子浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，得标准工作曲线，如图6所示。可见，在535nm处的发射强度与2.0×10^-6m(0.2当量)至9.0×10^-5m(9当量)范围内的fe³⁺离子浓度之间存在线性关系，相关系数为0.9897。依据检测限为空白样品获得的荧光强度标准偏差的三倍计算，本方法采用探针naptp荧光检测fe³⁺离子的检测限为8.05×10^-7m。

实施例3(探针naptp对fe³⁺离子的选择性)

通过加入50当量的不同金属离子(以水溶液的形式)，测量了naptp-ctab选择性。测试的金属来自ba²⁺，co²⁺，cu²⁺，zn²⁺，fe²⁺，ag⁺，ni²⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，cr³⁺，k⁺，mn²⁺和na+的相应化合物。

即使在添加fe³⁺时立即(3秒内)进行naptp-ctab检测，为了进行选择性研究，在与其他金属离子作用5.0分钟后记录荧光光谱。

该研究证实了探针在选定的金属离子组中对fe³⁺的高选择性。如图7、图8所示，只有fe³⁺诱导荧光最大值535nm显著增加，与空白探针相比，fe³⁺的选择性检测具有6倍的“开启”响应。除了cd²⁺和hg²⁺之外，其他阳离子在加入每个阳离子后，直到30分钟后都不会在535nm处发生任何发射强度变化。即使cd²⁺和hg²⁺诱导荧光增加，fe³⁺诱导的荧光强度分别比模拟生理条件下hg²⁺和cd²⁺的荧光强度高5.6倍和3.5倍。该结果表明该系统是非常好的传感器，可用于识别fe³⁺离子。

实施例4(探针naptp对水体内fe³⁺离子的检测)

以实施例2获得的图6为标准工作曲线。

将10μmol·l^-1萘酰亚胺基探针加入含有0.2mmol·l^-1十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的待测水体中，测出其荧光强度。

从图6的标准工作曲线中，读出待测水体中fe³⁺离子的含量，实现定量检测。

综上所述，本发明提供的可用于选择性检测fe³⁺离子的荧光探针，由4-哌嗪-萘酰亚胺和4-哌嗪-苯甲醛通过2,6-双(氯甲基)吡啶连接成的化合物与fe³⁺离子结合，利用反应物和产物之间的荧光差别，可实时高选择性、高灵敏性地的检测fe³⁺离子。具体来说，本发明的荧光探针在390nm激发，535nm发射，对fe³⁺离子具有很高的选择性和灵敏度，在fe³⁺离子与萘酰亚胺基探针-ctab的水溶液混合后三秒钟立即发生荧光增加，响应速度很快，检测最低fe³⁺离子浓度达8.05×10^-7mol·l^-1，灵敏度高，还可定量检测fe³⁺离子。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。