一种猪细小病毒的分离方法与流程

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒的分离方法。

背景技术：

猪细小病毒(porcineparvovirus,ppv)属于细小病毒科细小病毒属成员，是一种自我复制型病毒。ppv是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，可导致母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。ppv主要通过消化道和呼吸道感染，公猪、育肥猪、母猪的感染大多是因为接触污染的饲料和饮水，ppv也可以通过生殖道进行传播。带毒猪是ppv的主要传染源，带毒猪的分泌物和排泄物中的病毒可保持感染数月，被其污染的圈舍至少在4个月内仍具感染性，这主要是因为ppv对热稳定,对许多常用的消毒剂具有抵抗力，因此，污染的圈舍是ppv的主要储藏所。猪是ppv唯一的易感动物，不同年龄、性别的家猪和野猪均可感染，此外牛、绵羊、猫、豚鼠、小鼠和大鼠等动物血清中也存在ppv的特异性抗体。从20世纪60年代中期分离确定ppv以来，相继在欧洲、亚洲、美洲等地区分离到该病毒，目前该病毒已成世界性分布，导致全球养猪业经济损失严重。

鉴于该病在世界范围内流行，严重危害养猪业，猪细小病毒的快速分离鉴定对于猪细小病毒病的控制具有重要作用，但传统的病毒分离方法周期较长，病毒样品处理过程较为繁琐，而且易污染，分离的病毒纯度还不高，不利于猪细小病毒病的及时诊断，因此，发明一种猪细小病毒的快速分离鉴定方法，对于该病的迅速诊断及研究具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种猪细小病毒快速分离鉴定方法的技术方案，该方法为猪细小病毒病的诊断及研究提供依据。

所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取血管丰富、活力旺盛9-10日龄spf鸡胚，胚体挑出来后，置于ph7.0-7.4含小檗碱的pbs溶液漂洗，去掉胚体的四肢、头部及内脏，将剩余的胚体剪成呈1mm³的小块，经pbs溶液漂洗后，按体积比80:1-120:1分别加入pbs溶液与2.5%的胰酶溶液，充分混匀，静置3-5min后，再加入含2%-5%的胎牛血清终止消化，800-1200r/min离心8-10min，弃去上清，并用含2%-5%的胎牛血清将沉淀重悬，通过细胞过滤器过滤到细胞瓶中，取少量进行计数，然后分装于细胞瓶中置于37℃，5%的co2培养箱中培养；

2）无菌采取母猪繁殖的死胎、木乃伊胎的实质器官心、肝、脾、肺、肾，放置绞肉机中绞碎，向肉糜中加入肉糜总质量1-3倍的d-hanks液，经胶体磨充分研磨，混合均匀，将得到的混合液置于高压匀质机内，在匀质处理过程中温度控制在25℃以下，即得到匀浆处理液，在匀浆处理液中按1:1-1:3加入d-hanks液，混合均匀，静置20-30min后，进行分装离心，3000-5000r/min，离心8-15min，取上清待用，将得到的上清液，首先通过孔径150kd-200kd的中空纤维膜微滤系统进行微滤处理，收集微滤液，按1:8-1:10加入d-hanks液稀释，将稀释好的微滤液再通过0.22um的微孔滤膜进行过滤，收集滤液，即猪细小病毒原液；

3）在已培养24h的生长良好的原代cef细胞，弃去细胞培养液，将猪细小病毒原液与细胞培养液按体积比1:8-1:10加入，将细胞瓶置于37℃，5%co2培养箱中孵育1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养90-96h，每天观察细胞病变，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存。

所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于所述的步骤1）中ph7.0-7.4含小檗碱的pbs溶液每1000ml由以下成分组成：氯化钠6-10g、

氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、

含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g、小檗碱1-3mg；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于所述的步骤1）中ph7.0-7.4含小檗碱的pbs溶液每1000ml由以下成分组成：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、

含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g、小檗碱1-3mg；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于所述的步骤1）中d-hanks液每1000ml由以下成分组成：氯化钠8-10g、氯化钾0.4-0.6g、含1个结晶水的磷酸氢二钠0.04-0.08g、磷酸二氢钾0.04-0.06g、碳酸氢钠0.3-0.5g、

酚红0.01-0.02g；将以上各成分充分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明所提出的一种猪细小病毒的分离方法，病料的处理方法无需冻融，经过绞肉机、高压匀质机、中空纤维膜滤过系统等，机械化程度高，同时又保证了病毒的完整性，省时省力。

2、本发明所提出的一种猪细小病毒的分离方法，相比猪源细胞的制备，原代cef细胞制备简单快速，成本低，大大缩短了病毒的分离周期，有利于猪细小病毒病的及时诊断和研究。

3、本发明所提出的一种猪细小病毒的分离方法，是将分离的病毒直接接种在分离的禽源的cef细胞中，其获的病变明显、病毒含量高的病毒，为猪细小病毒的培养寻找了一种新的易感细胞。

附图说明

图1为ppvpcr鉴定结果；

图2为应用鼠抗ppv的免疫血清对接种病毒的细胞培养物进行间接免疫荧光试验图；

图3为应用鼠抗ppv的免疫血清对接种正常的细胞培养物进行间接免疫荧光试验图。

图1中：1:阴性对照；2：阳性对照；3：所分离的毒株；m：dl1000bp。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：cef原代细胞的制备

取血管丰富、活力旺盛9-10日龄spf鸡胚，消毒后用大头镊子将鸡胚体气室轻轻地敲破，暴露出胚体，小心翼翼地将胚体挑出来后，置于ph7.0含小檗碱的pbs溶液（每1000ml含有氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g、小檗碱1-3mg；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用；或氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g、小檗碱1-3mg）漂洗一次，然后去掉胚体的四肢、头部及内脏，将剩余的胚体剪成呈1mm³的小块，经pbs溶液漂洗后，按80:1、90:1或120:1（v:v）分别加入pbs溶液与2.5%的胰酶溶液，充分混匀，静置5min后，再加入含2%的胎牛血清终止消化，之后按1000r/min离心8min，弃去上清，并用含2%的胎牛血清将沉淀重悬，通过细胞过滤器过滤到细胞瓶中，取少量进行计数，最后分装于细胞瓶中置于37℃，5%的co2培养箱中培养。

实施例2病料的采集与处理

无菌采取繁殖母猪的死胎、木乃伊胎的实质器官心、肝、脾、肺、肾，放置绞肉机中绞碎，向肉糜中加入肉糜总质量2倍的d-hanks液，经胶体磨充分研磨，混合均匀。将得到的混合液置于高压均匀质机内，在匀质处理过程中温度控制在25℃以下，即得到匀浆处理液。在匀浆处理液中按1:1、1:2或1:3加入d-hanks液（每1000ml由以下成分组成：氯化钠8-10g、氯化钾0.4-0.6g、含1个结晶水的磷酸氢二钠0.04-0.08g、磷酸二氢钾0.04-0.06g、碳酸氢钠0.3-0.5g、酚红0.01-0.02g；将以上各成分充分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。），混合均匀，静止25min后，进行分装离心，按3000r/min，离心10min，取上清待用。将得到的上清液，首先通过孔径200kd的中空纤维膜微滤系统（购买于天津膜天膜工程技术有限公司）进行微滤处理，收集微滤液，按1:8、1:9或1:10加入d-hanks液稀释，将稀释好的微滤液再通过孔径在超滤系统，收集滤液再通过0.22um的微孔滤膜进行过滤，收集滤液，即猪细小病毒原液。

实施例3：病毒的细胞接种

将已培养24h生长良好的原代cef细胞，弃去细胞培养液，将病毒原液与细胞培养液按1:8、1:9或1:10（v:v）加入，同时设ppv的阳性对照和空白对照组，再置于37℃，5%co2培养箱中孵育1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养至90h，每天观察细胞病变，阴阳性对照组均成立，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存。

试验例猪细小病毒的分离鉴定

1材料

1.1猪细小病毒的分离

按本发明实施例1-3分离。

1.2dmem基础培养基、胎牛血清购于gibco公司。

1.30.5%豚鼠红细胞，由浙江美保龙生物技术有限公司研发中心自制。

1.4猪细小病毒阳性血清、猪细小间接免疫荧光检测试剂盒，购于中国兽医药品监察所。

1.5猪细小病毒阳性毒株，由浙江美保龙生物技术有限公司研发中心保存。

1.6pcr相关试剂，购于大连宝生物公司。

2方法

2.1病毒含量测定

将由实施例3收获的ppv细胞病毒液，用dmem基础培养液作连续10倍稀释，按0.1ml/孔转入96孔铺满单层的cef细胞培养板中，置于37℃5%的培养箱中培养4d，每天观察细胞病变并记录，按reed-muench法计算tcid50。

2.2微量中和试验

将猪细小病毒标准阳性血清、猪瘟阳性血清分别进行10倍梯度稀释与200个tcid50的细胞病毒液混匀，置于37℃下，中和1h，接种到96孔细胞板中，每个稀释度8孔，每空100ul，并设有未经血清处理的阳性对照和正常细胞阴性对照，连续观察5d。

2.3血凝试验

将收获的病毒细胞培养物，在96孔u板上用pbs按1:2、1:4、1:8…等倍比稀释病毒原液，用0.5%的豚鼠红细胞作血凝试验，每孔加红细胞50ul，以50%红细胞凝集为终点，样品出现凝集终点的最高稀释度为ha滴度，同时设红细胞对照。

2.4pcr鉴定

本试验根据genbank发表的猪细小病毒参考毒株nadl-2株vp2基因核苷酸序列，应用oligo6.0及primer5.0等软件，设计出一对引物，上游引物（p1）：tggtctccttctgtggtagg，下游引物（p2）：cagaatcagcaacctcac，扩增片段为445bp。利用dna抽提试剂盒提取病毒dna，以病毒dna为模板，采用25ul的pcr反应体系：pcrmastermix12.5ul，上、下游引物各１ul，模板dna１ul，ddh2o8.5ul，反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃5min，并将产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照记录结果，同时设阴阳性对照。

2.5免疫荧光试验

取接种病毒和未接种病毒60h的细胞培养物，弃去培养上清液，按照猪细小病毒间接免疫试剂盒说明书进行试验，同鼠抗ppv血清37℃作用1h，进行免疫荧光染色，镜检观测，并拍照记录。

3结果

3.1tcid50含量测定结果

利用reed-muench法对所分离毒株的半数细胞感染量进行测定，各稀释度病毒cpe结果见表1，经计算得出:tcid50=10^-5.375/0.1ml

表1病毒毒价测定结果

3.2微量中和试验结果

结果显示，ppv标准阳性血清可明显抑制细胞出现cpe，且能够特异中和所分离病毒；而猪瘟阳性血清对照孔及阳性对照孔均出现cpe，阴性细胞对照无cpe孔出现，以上结果表明，所分离病毒为猪细小病毒。

3.3血凝试验结果

cef细胞培养的分离的细小病毒能够凝集0.5%豚鼠红细胞，对该病毒液进行倍比稀释，按常规微量法进行血凝试验，检测血凝效价为1：256，

表2血凝试验结果

注：“++++”表示强阳性；“+++”表示阳性；“+-”表示弱阳性；“-”表示阴性

3.4pcr鉴定结果

以所分离猪细小病毒dna为模板，pcr扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，置于紫外灯光下观察，并用凝胶成像系统拍照。由图1可见，所分离病毒扩增结果与预期结果相符，均为455bp。

3.5免疫荧光试验

应用鼠抗ppv的免疫血清对接种病毒的细胞培养物和未接种病毒的对照细胞培养物进行间接免疫荧光试验，结果表明，接种病毒的细胞培养物多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现绿色闪亮荧光图2；正常的细胞未见有绿色荧光图3。

4结论

综上所述，本发明所提出的猪细小病毒的分离方法，机械化程度高，简单方便快捷，大大缩短病毒鉴定时间，不仅可以获得病毒含量、纯化水平高的病毒，还为猪细小病毒的培养寻找了一种新的易感细胞。