本发明涉及农用微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种微生物杀虫剂的制备方法。
背景技术：
植物病虫害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(fao)统计每年因植物遭受病害造成的减产平均损失为总产量的15％～20％。长期以来，用于防治或扑灭农田害虫制剂一般均为化学农药，如六六六、敌敌畏等。长期频繁使用化学农药，导致害虫抗药性的出现，使化学农药的效力逐渐降低。目前，主要解决方式是加大用药量，直接导致农业成本提高；害虫抗药性加强，防治难度加大；天敌被杀死，生态平衡遭到破坏；毒害物质在农副产品中残留、积累，危害广大人民的身体健康。因此，寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用人员的共识。
微生物杀虫剂是利用微生物活体或其代谢产物来防治害虫的。它具有特异性强，防治效果好，对人畜安全，不破坏生态平衡，害虫不易产生抗药性等优点。目前的微生物杀虫剂主要包含三类：1、细菌类杀虫剂：细菌杀虫剂是应用最早的微生物杀虫剂，根据对昆虫致病性的不同，分为转性病原体、碱性病原体和潜势病原体。目前被开发成产品投入实际使用的主要有4种：伯克氏霍尔德菌属、球形芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌，其中伯克氏霍尔德菌属能有效抑制病原菌在植物表面的存活，显著提高作物抗病能力，促进作物生长。2、真菌类杀虫剂：真菌类杀虫剂种类繁多，目前记载的约有800多种，其中大部分是兼性或转性病原体，研究应用较多的有白僵菌、绿僵菌、拟青霉菌、轮枝菌等。但其生长和繁殖在很大程度上受外界条件的限制，在实际应用中收到环境限制。3、病毒类杀虫剂：昆虫病毒的感染途径主要有食入感染和皮肤感染，目前该类制剂正处于研发阶段，工业化生产还不成熟。
综上，现有的微生物杀虫剂在实际应用过程中应用范围较为单一，菌种间的拮抗作用强，杀虫谱较窄；在工业化应用和环境适应性、抗逆性等方面现有产品也存在诸多不足，限制了微生物制剂在农作物杀虫上的广泛应用。
技术实现要素：
本发明的目的是通过菌种选育和发酵工艺优化，设计出一种工业化微生物杀虫剂的生产方法，即利用伯克氏霍尔德菌属作为生产菌株，应用本发明所设计的工艺方案和优化的培养基配方，增强产品的杀虫性能，并扩展其实际应用范围。
为实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下：
一种伯克氏霍尔德菌属细菌发酵方法，其包含如下步骤：
步骤1：将伯克氏霍尔德菌属细菌接种于斜面培养基进行斜面培养；
步骤2：将步骤1得到培养液接种于摇瓶培养基中进行摇瓶培养；
步骤3：将步骤2得到的培养液接种于种子培养基中进行种子培养；
步骤4：将步骤3得到的培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养；
步骤5：将步骤4得到的发酵液进行离心，将沉淀物；烘干，粉碎即得。
优选的，所述伯克氏霍尔德菌属细菌发酵方法，其包含如下步骤：
步骤1：伯克氏霍尔德菌属细菌斜面培养
将伯克氏霍尔德菌属细菌接种于斜面培养基进行斜面培养，接种质量百分比为5～10％，所述斜面培养温度为28℃～32℃，时间为24h～48h，所述斜面培养基中各组分的质量百分比为：氯化钠0.5％，蛋白胨0.5％～1％，琼脂粉1.8％～2％，其余为水，将ph值调整至6.5～7.5；
步骤2：伯克氏霍尔德菌属细菌摇瓶培养
将步骤1得到培养液接种于摇瓶培养基中进行摇瓶培养，接种质量百分比为5～10％，所述摇瓶培养温度为28℃～32℃，时间为24h～36h，转速为180rpm～220rpm，所述摇瓶培养基中各组分的质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，其余为水，将ph值调至6.5～7.5；
步骤3：伯克氏霍尔德菌属细菌种子培养
将步骤2得到的培养液接种于种子培养基中进行种子培养，所述种子培养温度为28℃～32℃，时间为24h～48h，搅拌转速为200rpm，接种质量百分比为1％～2％，每分钟通气比(空气体积：发酵液体积)为0.5:1～1:1，所述种子培养基中各组分的质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，其余为水，将ph值调至6.5～7.5，装料系数为0.5～0.8；
步骤4：伯克氏霍尔德菌属细菌发酵培养
将步骤3得到的培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养的温度为28℃～32℃，时间为24h～48h，接种质量百分比为1％～2％，起始搅拌转速为200rpm，当溶解氧低于20％时增加搅拌转数和通气量，维持溶氧在20％以上，当发酵液中菌体数量≥5×108cfu/ml时发酵结束，将发酵罐液体排出，装料系数为0.5～0.8；
步骤5：将步骤4得到的发酵液进行离心，将沉淀物；烘干，粉碎即得。
优选的，所述步骤4中所述发酵培养基中各组分的质量百分比为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，消泡剂0.005％～0.02％，其余为水，将ph值调整到7.0。
所述步骤4中所述发酵培养基中各组分的质量百分比为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，石菖蒲提取物0.8％，消泡剂0.005％～0.02％，其余为水，将ph值调整到7.0。
优选的，所述步骤4中所述发酵培养基中各组分的质量百分比为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，石菖蒲提取物0.4％，桑叶提取物0.4％，消泡剂0.005％～0.02％，其余为水，将ph值调整到7.0。
各步骤中培养基的ph通过0.1mnaoh或0.1mhcl进行调节。
本发明中的接种质量百分比是指接种的培养液占培养基的质量百分比。
本发明提供了一种伯克氏霍尔德菌属细菌，由前述发酵方法制备得到。
本发明还提供了一种微生物杀虫剂，其含有所述的伯克氏霍尔德菌属细菌。
本发明还提供了一种微生物杀虫剂，其包含80-90重量份的伯克氏霍尔德菌属细菌和10-20重量份的木犀草素。
本发明所述的微生物杀虫剂在使用时，与水进行混合均匀即可，每1升水加入5-30g微生物杀虫剂。
为了防止伯克氏霍尔德菌属细菌等或有效成分因腐败而失活，本发明还可以添加稳定剂，提高微生物杀虫剂的保质期，对稳定剂的选择尽量选择对人体无害的，这样在对蔬菜、果树等进行杀虫的过程中不会损害人体健康。
为实现这一目的，本发明还提供了一种更优选的微生物杀虫剂，其包含80-90重量份的伯克氏霍尔德菌属细菌和10-20重量份的木犀草素，1-5份稳定剂。
所述稳定剂为佛手柑内酯和/或紫苏醛。
优选的，所述稳定剂由20-30wt％佛手柑内酯和70-80wt％紫苏醛组成。
本发明中所述伯克氏霍尔德菌属细菌优选为burkholderiaxenovorans。
本发明的有益效果为：
1、本发明的微生物杀虫剂依附于植物体生长健全生育过程；可以分解连续种植田地中积畜的有害物质，用于植物虫害防控，促进植物生长和生物修复等功能。伯克氏霍尔德菌属细菌能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体(pyochenlin，pyoverdine)、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、cepaciamidea、cepacidinea、cepacina等。现已应用于生物防治，分解有毒物质等领域，使害虫进食后患败血症死亡，对瓜果、蔬菜、果树、大田类作物的菜青虫、小菜蛾、甜蛾、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、烟青虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、二化螟、小地老虎等都有毒杀作用。
2、本发明在研究中发现，添加石菖蒲提取物和桑叶提取物，对伯克氏霍尔德菌属细菌的培养非常有利，极大地提高了伯克氏霍尔德菌属细菌的生长速率和单位时间内的产率，是本发明的重大发现。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步阐述。
实施例中的伯克氏霍尔德菌属细菌为burkholderiaxenovoranslb400，缩写为b.xenovorans(lb400)，购买自瑞典哥德堡大学菌种保藏中心，菌种编号为ccug46959。
实施例中蛋白胨为福建仙游三和生物科技有限公司提供医药级蛋白胨。
实施例中磷酸氢二钾由成都蓝剑化工有限公司提供。
实施例中消泡剂为宿州市华润化工有限责任公司提供sxp-106有机硅消泡剂。
实施例中牛肉膏为浙江东成药业有限公司提供的牛肉粉(培养基专用)。
实施例中所述石菖蒲提取物的制备方法为：将石菖蒲粉碎，过16目筛，得到石菖蒲粉末；将石菖蒲粉末与水以固液质量比1：20混合均匀；在超声功率150w、超声频率40khz的条件下于60℃超声提取2小时，以转速为5000转/分进行离心20min，取上层清夜在真空度0.06mpa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.05g/ml(25℃)，得到石菖蒲提取物。石菖蒲，拉丁学名：acorustatarinowiischott，为天南星科植物石菖蒲(acorustatarinowii)的根茎。具体采用安国市跃杰中药材有限公司提供的石菖蒲。
实施例中所述桑叶提取物的制备方法为：将桑叶粉碎，过16目筛，得到桑叶粉末；将桑叶粉末与水以固液质量比1：20混合均匀；在超声功率150w、超声频率40khz的条件下于60℃超声提取2小时，以转速为5000转/分进行离心20min，取上层清夜在真空度0.06mpa、温度为70℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.08g/ml(25℃)，得到桑叶提取物。桑叶为亳州百川药业有限公司提供的霜桑叶。
木犀草素，cas号：491-70-3。
佛手柑内酯，cas号：484-20-8。
紫苏醛，cas号：18031-40-8。
各实施例的各步骤中培养基的ph通过0.1mnaoh或0.1mhcl进行调节。
实施例1
步骤1：伯克氏霍尔德菌属细菌斜面培养
将伯克氏霍尔德菌属细菌接种于斜面培养基进行斜面培养，接种质量百分比为5％，所述斜面培养温度为28℃，时间为24h，所述斜面培养基中各组分的质量百分比为：氯化钠0.5％，蛋白胨1％，琼脂粉1.8％，其余为水，将ph值调整至7.0；
步骤2：伯克氏霍尔德菌属细菌摇瓶培养
将步骤1得到培养液接种于摇瓶培养基中进行摇瓶培养，接种质量百分比为10％，所述摇瓶培养温度为28℃，时间为24h，转速为220rpm，所述摇瓶培养基中各组分的质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，其余为水，将ph值调至7.0；
步骤3：伯克氏霍尔德菌属细菌种子培养
将步骤2得到的培养液接种于种子培养基中进行种子培养，所述种子培养温度为32℃，时间为48h，搅拌转速为200rpm，接种质量百分比为2％，每分钟通气比(空气体积：发酵液体积)为0.7:1，所述种子培养基中各组分的质量百分比为：磷酸氢二钾0.2％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，其余为水，将ph值调至7.0，装料系数为0.7；
步骤4：伯克氏霍尔德菌属细菌发酵培养
将步骤3得到的培养液接种于发酵培养基中，所述发酵培养的温度为32℃，接种质量百分比为2％，起始搅拌转速为200rpm，当溶解氧低于20％时增加搅拌转数和通气量，维持溶氧在20％以上，当发酵液中菌体数量为5×108cfu/ml时发酵结束，将发酵罐液体排出，所述发酵培养基中各组分的质量百分比为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，消泡剂0.005％，其余为水，将ph值调整到7.0，装料系数为0.7；
步骤5：将步骤4得到的发酵液进行离心，将沉淀物；烘干，粉碎即得。
在本实施例中，步骤4的发酵培养经过31h后，发酵液中菌体数量达到了5×108cfu/ml。
实施例2
与实施例1基本相同，其区别仅在于：
所述步骤4中所述发酵培养基中各组分的质量百分比为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，石菖蒲提取物0.8％，消泡剂0.005％，其余为水，将ph值调整到7.0。
在本实施例中，步骤4的发酵培养经过28h后，发酵液中菌体数量达到了5×108cfu/ml。可见，在发酵培养基中添加石菖蒲提取物，会加快伯克氏霍尔德菌属细菌的发酵速度，在相同的发酵时间内，伯克氏霍尔德菌属细菌的产率更高。
实施例3
与实施例1基本相同，其区别仅在于：
所述步骤4中所述发酵培养基中各组分的质量百分比为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，石菖蒲提取物0.4％，桑叶提取物0.4％，消泡剂0.005％，其余为水，将ph值调整到7.0。
在本实施例中，步骤4的发酵培养经过24h后，发酵液中菌体数量达到了5×108cfu/ml。可见，在发酵培养基中添加桑叶提取物，会进一步加快伯克氏霍尔德菌属细菌的发酵速度，在相同的发酵时间内，伯克氏霍尔德菌属细菌的产率更高。
实施例4
一种微生物杀虫剂，其组成为100wt％的实施例3制备的伯克氏霍尔德菌属细菌。
实施例5
一种微生物杀虫剂，其由90wt％的实施例3制备的伯克氏霍尔德菌属细菌和10wt％的木犀草素混合均匀得到。
对比例
一种微生物杀虫剂，其组成为100wt％的木犀草素。
测试例1
对实施例4-5和对比例1的微生物杀虫剂进行防治柑橘上蚜虫的药效进行测试。
试验地：上海某柑橘果园，正值6月中旬，柑橘蚜虫爆发。
供试药剂：将实施例4-5和对比例1所得微生物杀虫剂分别与水混合均匀，制成微生物杀虫剂喷雾剂，每升水中含有10g微生物杀虫剂。
防治对象：柑橘蚜虫。
试验设计：设置4组，分别为实施例4试验组、实施例5试验组、对比例1试验组和空白对照组，每组面积为约100m2的正方形，含9棵柑橘树(3行×3列)，每组间留有保护行，保护行为3m。每个试验组分别使用微生物杀虫剂喷雾10kg，均匀喷雾，空白对照组喷洒10kg的水。分别于施药后第1、3、7、14天调查残虫量，采用下列公式计算防治效果：
虫口减退率(％)＝(药前虫口数-药后虫口数)/药前虫口数×100％
具体结果见表1。
表1：柑橘蚜虫防治结果表
测试例1中，空白对照组的虫口减退率为负数，代表虫口数在增加，没有减退。实施例4-5使用本发明的微生物杀虫剂，有效的降低了虫口数，在施药后第3天开始，药效就已十分显著，实施例5的微生物杀虫剂由90wt％的伯克氏霍尔德菌属细菌和10wt％的木犀草素组成，其比实施例4单纯的是用伯克氏霍尔德菌属细菌杀虫效果更好，而且在施药后第14天，仍然有显著的效果，实施例4单纯的使用伯克氏霍尔德菌属细菌，在施药后第14天杀虫效果有所下降，可能与部分蚜虫产生了耐药性有关。
实施例6
一种微生物杀虫剂，其由90重量份的实施例3制备的伯克氏霍尔德菌属细菌、10重量份的木犀草素、1重量份佛手柑内酯和4重量份紫苏醛混合均匀得到。
实施例7
一种微生物杀虫剂，其由90重量份的实施例3制备的伯克氏霍尔德菌属细菌、10重量份的木犀草素、5重量份佛手柑内酯混合均匀得到。
实施例8
一种微生物杀虫剂，其由90重量份的实施例3制备的伯克氏霍尔德菌属细菌、10重量份的木犀草素、5重量份紫苏醛混合均匀得到。
测试例2
对实施例5-8的微生物杀虫剂进行防治蔬菜上蚜虫进行稳定性测试。
将实施例5-8的微生物杀虫剂避光常温密封贮存12个月后，测试对蚜虫的防治效果。
试验地：东北某一蔬菜试验田，正值8月中旬，蔬菜蚜虫爆发。
供试药剂：将实施例5-8所得微生物杀虫剂分别与水混合均匀，制成微生物杀虫剂喷雾剂，每升水中含有10g微生物杀虫剂。
防治对象：蔬菜蚜虫。
试验设计：设置5组，分别为实施例5-8的试验组和空白对照组，每组面积为约50m2的正方形，含蔬菜(10行×10列)。试验组分别使用实施例5-8的杀虫剂6kg，均匀喷雾，空白对照组喷洒6kg的水。分别于施药后第7、14天调查残虫量，采用下列公式计算防治效果：
虫口减退率(％)＝(药前虫口数-药后虫口数)/药前虫口数×100％
具体结果见表2。
表2：蔬菜蚜虫防治结果表
测试例2中，空白对照组的虫口减退率为负数，代表虫口数在增加，没有减退。实施例5-8使用本发明的微生物杀虫剂，有效的降低了虫口数。与实施例5相比较，实施例6-8的微生物杀虫剂添加了稳定剂在贮存12个月后，依然保持了良好的杀虫药效。以上对本发明的实施进行了说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的保护范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。