检测片状边虫的引物对、套组及方法与流程

【技术领域】

本申请系关于一种片状边虫的快速诊断，尤指一种检测片状边虫的引物对、套组及方法。

【现有技术】

片状边虫(anaplasmaplatys，旧名为ehrlichiaplatys)，或称扁形边虫，是造成热带及温暖地区之犬周期性血小板减少症(caninecyclicthrombocytopenia)之病原虫，其分布在地中海区域、亚洲、中东、非洲、澳洲及美国。犬边虫症(canineanaplasmosis)为一种广泛散播的疾病，因此又称为犬只急重症(canineemergingdisease)，而棕色犬壁虱(browndogtick，学名为rhipicephalussanguineus)及革蜱属(dermacentorspp.)被认为是传播此病原虫的媒介。片状边虫是目前所知唯一感染血小板的立克次体，其生物体在血小板中呈圆形、椭圆形或豆形的蓝色细胞包涵体，且径长介于0.35至1.25μm之间。

片状边虫感染的症状包含发烧、食欲不振、嗜睡、因病原虫破坏宿主血小板细胞造成的初级凝血异常、中度贫血、及淋巴结肿大，且菌血症及接续的血小板低下症(血小板数量低于20,000/μl)会在间隔一到两周的时间复发。若是与犬艾利希体(ehrlichia.canis)共同感染，将可能导致更严重的病症。

目前用于片状边虫诊断的方法包括血液抹片、血清诊断及分子诊断，但前述方法皆有其限制。

片状边虫的诊断可透过镜检染色的血液抹片或血液棕黄层(buffycoat)抹片(例如giemsa染色法或diff-quik染色法)来辨识血小板中的病原虫。然而，由于为循环的寄生虫血病(cyclicparasitemia)，病原虫可能不存在或是以非常低的数量存在血液抹片上，因此这个方法是不可靠的，且灵敏度低及费时。

血清诊断则有助于辨识片状边虫抗体的存在，但可能无法侦测出疾病急性期的早期感染。血清诊断的限制更在于交叉反应，尤其常见于艾利希体属(ehrlichiaspp.)及边虫属(anaplasmaspp.)之间。此外，血清诊断也无法区分出是曾经感染(postexposure)或是正在感染(presentinfection)。

而诊断片状边虫最佳的方式便是分子诊断，尤其是利用聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,pcr)进行检测。聚合酶连锁反应是一种更灵敏且更具专一性的技术，提供了诊断边虫症(anaplasmosis)的另一替代方案，而16srrna的基因序列即被用来分辨各种种类的边虫。举例而言，由bioingentech公司所提供的片状边虫检测套组(vetpcra.platysdetectionkit)可用来检测片状边虫感染，且诊断快速、准确及可靠。然而，此检测套组仍需结合终端pcr侦测方法，例如凝胶电泳(gelelectrophoresis)，使得整个检测过程需花费3小时，仍是相当费时及费力。

因此，提供一种可改善现有技术缺点之片状边虫诊断方法实为本领域之人士需要努力的方向。

技术实现要素：

本案的目的在于提供一种用以检测片状边虫(anaplasmaplatys)的引物对，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出片状边虫感染。

本案的另一目的在于提供一种用以检测片状边虫(anaplasmaplatys)的套组，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出片状边虫感染。

本案的又一目的在于提供一种用以检测片状边虫(anaplasmaplatys)的方法，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出片状边虫感染。

为达上述目的，本申请之一较广义实施方案为提供一种用以检测片状边虫(anaplasmaplatys)的引物对，包含一顺向引物及一逆向引物，其中，该顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，该逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’。该顺向引物及该逆向引物系用于实时聚合酶链锁反应(real-timepcr)。

又，本申请之另一较广义实施方案为提供一种用以检测片状边虫(anaplasmaplatys)的套组，包含一顺向引物、一逆向引物及一探针，其中，该顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，该逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’，以及该探针的序列为5’-ctcacccgtctgccactaac-3’。该顺向引物、该逆向引物及该探针系用于实时聚合酶链锁反应(real-timepcr)。又，该探针的5’端接上报导染剂(reporterdye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。

又，本申请之另一较广义实施方案为提供一种用以检测片状边虫(anaplasmaplatys)的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增片状边虫(anaplasmaplatys)的核酸分子，且所采用之顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’，以及探针的序列为5’-ctcacccgtctgccactaac-3’。该探针的5’端接上报导染剂(reporterdye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。

【附图说明】

第1图显示顺向引物、逆向引物及探针对应于16srrna基因序列的位置。

第2图显示顺向引物、逆向引物及探针的dna序列。

第3a图及第3b图显示实时聚合酶链锁反应扩增结果的分析。

【实施方式】

体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的方案上具有各种的变化，其皆不脱离本申请的范围，且其中的说明及图示在本质上系当作说明之用，而非用以限制本申请。

本申请系利用实时聚合酶链锁反应(real-timepolymerasechainreaction，简称real-timepcr)，又称定量聚合酶链锁反应(quantitativepolymerasechainreaction，简称为q-pcr)来进行片状边虫(anaplasmaplatys)的检测，且采用探针侦测系统(probe-baseddetection)。首先，具有专一性的顺向引物、逆向引物及探针会杂合到片状边虫的目标dna上，探针的5’端接上报导染剂(reporterdye)，3’端接上淬灭体(quencher)。在pcr扩增反应过程中，探针会被切割，使得报导染剂与淬灭体分离，即可侦测到报导染剂所发出的荧光。在一实施例中，报导染剂为fam荧光基团，淬灭体为bhq1基团。

在此试验中的目标dna为片状边虫的16srrna基因(基因库登录号为u54806.1)中的一段可变区域(variableregion)，其包含对片状边虫具有特异性的序列。本申请之pcr引物及探针系利用primer3软件所设计，且依gc含量及不含发夹结构(hairpinstructure)之基础进行选择。第1图显示所采用的顺向引物、逆向引物及探针对应于16srrna基因序列的位置，其中，顺向引物起始于基因序列第3个位置，探针起始于基因序列第44个位置，逆向引物起始于基因序列第74位置。利用此顺向引物、逆向引物及探针的组合将可扩增片状边虫dna而得出大小为72-bp的扩增子(amplicon)片段。第2图显示顺向引物、逆向引物及探针的dna序列，其中，顺向引物(序列编号1)大小为19-mer，逆向引物(序列编号2)大小为21-mer，探针(序列编号3)大小为20-mer。

为确认所采用的pcr引物及探针对片状边虫具有专一性，利用美国国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation,ncbi)提供的primer-blast系统对前述包含顺向引物及逆向引物的引物对及探针进行比对，结果显示没有其他相近的物种具有与本申请设计的引物对及探针完全相同的序列。此结果也显示本申请的引物对及探针的专一性相当高，且只能用来扩增及检测片状边虫的16srrna基因。

因此，本申请提供了一种用以检测片状边虫的引物对，包含一顺向引物及一逆向引物，其中，该顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，该逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’。本申请同时提供一种用以检测片状边虫的套组，包含一顺向引物、一逆向引物及一探针，其中，该顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，该逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’，以及该探针的序列为5’-ctcacccgtctgccactaac-3’。另一方面，本申请亦提供一种用以检测片状边虫的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增片状边虫的核酸分子，且所采用之顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’，以及探针的序列为5’-ctcacccgtctgccactaac-3’。

在另一些实施例中，由于本申请之引物对可专一地检测片状边虫，故只要是位于顺向引物及逆向引物序列位置之间的序列，皆可设计为探针序列，因此，本申请提供之检测片状边虫的套组或方法亦可不限制采用前述的探针序列，且探针可选择杂合至dna的任一股上，故相同位置的互补序列皆可做为探针序列。因此，与前述探针序列互补的序列亦可做为本申请之探针序列。

以下将以实例说明利用本申请设计之引物对及探针进行片状边虫的检测。

首先，取200μl以edta保存的待测全血样品进行dna萃取，其系利用qiagen提供的萃取套组qiaampdnabloodminikit来萃取，并溶在100μl的冲提缓冲液中。接着进行实时聚合酶链锁反应，其系利用bio-rad实时聚合酶链锁反应机器(cfx96)来执行。pcr反应混合物中包含10μl的kapafastprobeuniversalmastermix，250nm的顺向引物及逆向引物，及250nm的探针，其中，顺向引物的序列为5’-gtcgtagcttgctatgata-3’，逆向引物的序列为5’-ccatactactaggtagattcc-3’，以及探针的序列为5’-ctcacccgtctgccactaac-3’。将3μl的萃取dna模板加入至每一反应管中，并使总体积达20μl。pcr循环条件则先95℃3分钟，接着进行95℃3秒钟的变性(denaturation)及60℃20秒钟的退火(annealing)及延伸(extension)，重复40个循环。

阳性对照(positivecontrol)系为具有片状边虫部分16srrna基因片段的选殖载体(rbccloningsystem)。将此重组dna质体制备一系列十倍稀释液，分别为10,10²,10³,10⁴,10⁵,10⁶及10⁷拷贝/μl的稀释液。每一稀释液系进行二次重复(duplicate)分析，以测定片状边虫dna侦测的下限，以及实时聚合酶链锁反应扩增的线性关系及效率。

第3a图及第3b图显示实时聚合酶链锁反应扩增结果的分析。第3a图显示不同拷贝数的质体样本的扩增曲线，可看出本申请的检测方法具有相当高的灵敏度。第3b图显示本申请的检测方法具有相当好的线性关系，其r²为0.98，非常接近最佳理论值1.0，因此，本申请的检测方法可进行定量分析，用以估计临床样本中基因的拷贝数。

综上所述，本申请提供一种检测片状边虫的方法，其系利用实时聚合酶链锁反应及具有特异性的引物对及探针来进行侦测。本申请提供之方法具有高灵敏性，可在无临床症状的感染案例中检测到小量的片状边虫。此外，早期或急性期的诊断对于片状边虫的治疗非常关键，有些研究显示当犬只在边虫症急性期即获得治疗的话，可在24至48小时内快速复原，且在接受完整疗程后之预后相当良好。又，本申请提供之方法更具有高专一性，可区别出片状边虫及其他蜱媒病原虫，且有助于兽医师选择最适当的治疗方法。再者，对于治疗后复发的病症或是治疗失败的情形，本申请提供之方法亦可判断是否原始诊断有误，并降低输血感染。

纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由本领域技术人员任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附申请专利范围所欲保护者。

序列表

<110>台达电子国际（新加坡）私人有限公司

<120>检测片状边虫的引物对、套组及方法

<160>3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>1

gtcgtagcttgctatgata19

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>2

ccatactactaggtagattcc21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成探針

<400>3

ctcacccgtctgccactaac20