本发明具体涉及一种通过与固定化微生物共培养利用淀粉异养培养微藻的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
微藻自养培养过程中存在光限制问题，使得光合反应器的设计和运行比较困难，而且自养生长下由于细胞的生长受到光限制，细胞生长通常比较缓慢，培养周期较长，且最终生物量浓度较低，而较低的生物量浓度会进一步增加后续细胞采收过程的难度。部分藻类可以在无光源的条件下异养利用外源有机碳源进行生长，在异养培养，外源有机碳源的添加可以显著促进微藻培养过程中细胞的生长速率，大大缩短培养周期，并且可以达到较高的生物量浓度，此外，异养培养过程无需光照，反应器的设计、放大和运行比较简单。
在微藻的异养培养过程中，有机碳源是细胞生长唯一的能量来源，现有的异养培养过程通常应用纯的葡萄糖作为微藻培养的碳源，另外，也有部分应用甘油、乙酸盐等碳源的报道。但是，碳源的添加使得培养基的成本大大增加，碳源成本甚至可占到培养基总成本的80％。因此，寻找低廉高效的碳源对于降低微藻异养培养过程的成本，促进微藻异养培养的产业化具有重要意义。
淀粉是地球上天然生成的数量巨大的一类高分子碳水化合物，淀粉的结构是由单一的葡萄糖单元共价结合形成的高分子多糖，在自然界中，以颗粒形式广泛存在植物的种子、块茎或根部中。淀粉作为一类来源广泛、价格低廉的碳水化合物，是一种比较理想的碳源，但是由于微生物难以直接利用高分子的淀粉，且包括藻类在内的众多微生物不能分泌淀粉酶，因此，在许多微生物的培养过程中，难以直接利用淀粉。当前，有少许关于利用淀粉进行微藻异养/兼养培养的报道，但是上述研究中均需先将淀粉通过化学或酶法水解成葡萄糖或寡糖后再用于微藻的培养中，水解过程增加了微藻培养过程的单元操作，进而增加了生产成本。
技术实现要素：
针对微藻异养培养过程中碳源成本较高，同时难以直接利用价格低廉的淀粉作为碳源生长的问题，本发明提供了一种通过与固定化微生物共培养利用淀粉异养培养微藻的方法，先将具有胞外淀粉酶分泌能力的微生物进行固定化，然后将固定化的微球与微藻进行共培养，在该体系中，固定在介质中的微生物可以正常的分泌淀粉酶将淀粉水解为低聚糖、寡糖、葡萄糖等，微藻可以利用固定化细胞产生的单糖或寡糖进行生长，有效解决了微藻在异养培养下难以直接利用淀粉的问题，同时，细胞的固定化使得培养体系中微藻处于纯培养状态，在培养结束后，通过简单的过滤或沉降即可获得纯培养的藻液，可广泛适用于各种藻基生物产品的生产过程中。
为实现上述目的，本发明的一种通过与固定化微生物共培养利用淀粉异养培养微藻的方法包括以下步骤：
(1)配置培养基：在培养装置中，加入以淀粉作为有机碳源的常规的微藻培养基，灭菌冷却后待接种；
(2)接种：将培养至对数生长期的微藻细胞以一定的接种量接入；
(3)微生物细胞的固定化：将培养至对数生长期后期的具有胞外淀粉水解能力的微生物细胞进行固定化，然后将含固定化微生物的微球以特定的量添加到步骤(2)的培养液中，开始培养；
(4)培养及细胞收集：在适宜的温度及通气条件下进行培养，培养结束后，将含微生物的微球分离，获得纯藻液。
进一步地，步骤(1)中，所述培养装置是不同规格的摇瓶，板式反应器，气升式反应器，鼓泡塔反应器，但不包括机械搅拌式发酵罐等剪切力较高的反应器；所述淀粉包括玉米淀粉，小麦淀粉，米粉，薯类淀粉，野生植物来源的淀粉；所述淀粉的添加量为5～100g/l。
进一步地，步骤(2)中，所述微藻为小球藻、栅藻、衣藻、布朗葡萄藻、雨生红球藻等可以利用葡萄糖的淡水藻以及微拟球藻、三角褐指藻等海洋藻；微藻的接种量为2％～20％(v/v)。
进一步地，步骤(3)中，所述微生物为具有胞外淀粉水解能力的微生物，包括野生型的扣囊覆膜酵母(saccharomycopsisfibuligera)、黑曲霉(aspergillusniger)，毛霉，或者是利用基因工程改造后的工程菌株；所述固定化方法包括常规的吸附、包埋、交联；添加的固定化微球中含有的微生物干重为微藻细胞干重的5％～20％(w/w)。
进一步地，步骤(4)中，所述培养的温度为15～30℃；通气量为0.1～15vvm；培养的ph为6.5～9.5。
本发明提供的一种通过与固定化微生物共培养利用淀粉异养培养微藻的方法，解决了微藻难以利用成本低廉的淀粉类原料异养培养的问题，为降低微藻异养培养的碳源成本提供了新的途径，且可得到高浓度的纯藻液。
与现有的微藻异养培养过程相比，本发明的创新点及先进性在于：
(1)本发明提供的方法可以有效地解决了微藻异养培养过程中不能直接利用淀粉的问题，使得微藻的异养培养可以利用比较低廉的淀粉类原料进行，有效地降低了微藻培养过程的碳源成本；
(2)本发明提供的方法通过将微生物细胞固定化，实现了微藻的纯培养，与常规的共培养工艺相比，可以通过简单的过滤实现藻-菌的分离，最终获得纯培养的微藻细胞，可广泛适用于各种藻基生物产品的生产过程中。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制的实施例如下：
实施例1
(1)在2l气升式反应器中，加入含80g/l小麦淀粉的培养基，灭菌并冷却；
(2)将培养至对数生长期的椭圆小球藻以10％(v/v)的接种量接入；
(3)扣囊覆膜酵母培养至对数期后，通过海藻酸钙包埋的方法将其固定化，将固定化的微球以微藻细胞干重5％的酵母细胞含量添加到培养液中开始培养；
(4)在25℃、2vvm的通气量以及ph7.0的条件下培养，培养结束后收集藻液。
处理效果测试：
培养过程中未发现酵母细胞的泄露，微藻的最终浓度达到了3.8g/l。
实施例2
(1)在500ml三角瓶中，加入含100g/l玉米淀粉的培养基，灭菌并冷却；
(2)将培养至对数生长期的微拟球藻以20％(v/v)的接种量接入；
(3)黑曲霉培养至对数期后，通过卡拉胶包埋的方法将其固定化，将固定化的微球以微藻细胞干重20％的黑曲霉细胞含量添加到培养液中开始培养；
(4)在15℃、15vvm的通气量以及ph9.5的条件下培养，培养结束后收集藻液。
处理效果测试：
培养过程中未发现黑曲霉细胞的泄露，微藻的最终浓度达到了42.2g/l。
实施例3
(1)在1l鼓泡塔反应器中，加入含50g/l红薯淀粉的培养基，灭菌并冷却；
(2)将培养至对数生长期的雨生红球藻以5％(v/v)的接种量接入；
(3)具有淀粉水解活性的大肠杆菌工程菌培养至对数期后，通过戊二醛交联的方法将其固定化，将固定化的微球以微藻细胞干重12％的菌含量添加到培养液中开始培养；
(4)在30℃、0.1vvm的通气量以及ph6.5的条件下培养，培养结束后收集藻液。
处理效果测试：
培养过程中未发现细菌细胞的泄露，微藻的最终浓度达到了24.1g/l。
实施例4
(1)在5l板式反应器中，加入含5g/l木薯淀粉的培养基，灭菌并冷却；
(2)将培养至对数生长期的三角褐指藻以15％(v/v)的接种量接入；
(3)微小毛霉培养至对数期后，通过中空纤维包埋的方法将其固定化，将固定化的微球以微藻细胞干重10％的毛霉含量添加到培养液中开始培养；
(4)在18℃、5vvm的通气量以及ph7.5的条件下培养，培养结束后收集藻液。
处理效果测试：
培养过程中未发现微小毛霉细胞的泄露，微藻的最终浓度达到了1.4g/l。
实施例5
(1)在10l气升式反应器中，加入含30g/l大米淀粉的培养基，灭菌并冷却；
(2)将培养至对数生长期的莱茵衣藻以2％(v/v)的接种量接入；
(3)扣囊覆膜酵母培养至对数期后，通过角叉菜胶包埋的方法将其固定化，将固定化的微球以微藻细胞干重15％的酵母含量添加到培养液中开始培养；
(4)在26℃、10vvm的通气量以及ph8.0的条件下培养，培养结束后收集藻液。
处理效果测试：
培养过程中未发现酵母细胞的泄露，微藻的最终浓度达到了7.6g/l。
实施例6
(1)在2l三角瓶中，加入含60g/l野生植物块茎淀粉的培养基，灭菌并冷却；
(2)将培养至对数生长期的布朗葡萄藻以8％(v/v)的接种量接入；
(3)具有淀粉水解活性的酿酒酵母工程菌培养至对数期后，通过壳聚糖吸附的方法将其固定化，将固定化的微球以微藻细胞干重8％的菌含量添加到培养液中开始培养；
(4)在28℃、8vvm的通气量以及ph8.5的条件下培养，培养结束后收集藻液。
处理效果测试：
培养过程中未发现细菌细胞的泄露，微藻的最终浓度达到了18.3g/l。
以上实施例中，微藻的终浓度受微藻种类、反应器类型、培养条件的综合影响，但是综合各因素没有明显的规律可循。