本发明涉及一种杂交瘤细胞株及单克隆抗体，尤其是一种杂交瘤细胞株4a5及灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体。
背景技术：
灿烂弧菌隶属于属弧菌科（vibrionaceae），是刺参（apostichopusjaponicus）养殖中极为常见的刺参化皮病（腐皮综合征）的主要致病菌。该病传染性强、传播范围广，能引起刺参发生大面积的体表溃疡、口肿溃烂、身体萎缩、排脏等症状。此外，灿烂弧菌也能导致多种鱼类、双壳贝类、甲壳类和棘皮动物发病甚至死亡，使被感染的鱼体两侧，特别是靠近尾部处出现出血点，导致皮肤腐烂，形成溃疡，背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血，肾脏、肝脏糜烂等症状。因此，检测灿烂弧菌意义重大。目前，针对细菌的检测方法主要有传统的微生物学检测技术（平板培养法）、分子生物学方法及免疫学检测方法。平板培养法是操作相对简单，但过程复杂，耗时较长；分子生物学检测方法灵敏度高、特异性强，但需要特殊的仪器设备和专业人员，达不到快速、现场检测的目的，不适合在基层推广使用。免疫学检测方法具有操作相对简单、灵敏度高、检测时间短、处理样品多等特点，但是需要具有特异性强的抗体或抗原。现有灿烂弧菌单抗（单克隆抗体）是采用灿烂弧菌全菌制备的杂交瘤细胞株所分泌，特异性较差，难以应用于免疫学检测。
flgt是组成灿烂弧菌鞭毛蛋白中h环所不可缺少的结构蛋白，全长254个氨基酸，分子量大小约为30kda。flgt对维持正常的鞭毛功能有着重要的作用，当缺少flgt时，定子的正确装配以及鞭毛的运动功能都会受到影响。但是，迄今为止，并没有以flgt蛋白制备分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的杂交瘤细胞株的相关报道。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种杂交瘤细胞株4a5及灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体。
本发明的技术解决方案是：一种杂交瘤细胞株4a5，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.14311。
一种灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体，是杂交瘤细胞株4a5分泌的。
本发明是利用重组蛋白flgt作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4a5，所分泌的抗灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体更具有特异性，可应用于灿烂弧菌的免疫检测。
分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的杂交瘤细胞株4a5杂保藏日期：2017年7月5日；
分类命名：抗灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏号：cgmccno.14311。
具体实施方式
本发明的杂交瘤细胞株4a5，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.14311。杂交瘤细胞株4a5分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体。
杂交瘤细胞株4a5制备方法如下：
1.制备免疫抗原
（1）重组表达载体的构建：根据flgt核苷酸序列（flgt核苷酸序列如seqidno.1所示，762bp)设计引物进行pcr扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点sgfi和mlui，插入表达载体pet-22bt7启动子下游，构建flgt重组表达质粒；
（2）flgt重组蛋白的表达与纯化：以e.colibl21菌株为表达菌株，将flgt重组表达质粒转入表达菌株中进行flgt重组表达。裂解离心取沉淀，经过包涵体复性及纯化，获得纯化的flgt重组蛋白，即免疫抗原。
2.制备杂交瘤细胞株：采用免疫抗原免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4a5。
具体方法如下：
1.制备免疫抗原
1.1灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt的表达
原核表达载体pet-22bt7的构建：
以灿烂弧菌jz6基因组为模板，设计引物并通过pcr扩增后，得到flgt基因；具体过程如下：
pcr反应体系为50μl：
10×pcrbuffer（mg2+）5μl，dntpmixture（2mm）5μl，上下游引物各1μl（10μmol/l），blendtaq-plus（promega公司）0.5μl，jz6基因组dna模板1μl，灭菌去离子水补充至50μl。
pcr扩增程序为：
94℃预变性4min，94℃变性45s，58℃退火40s，72℃延伸60s，28个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到pcr扩增的ef-tu片段。
酶切反应：通过ndeⅰ（takara公司）和xhoⅰ（takara公司）双酶切pet22b载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段；通过ndeⅰ（takara公司）和xhoⅰ（takara公司）双酶切pcr扩增的ef-tu片段，通过酶切产物回收试剂盒回收ef-tu片段。
连接反应体系（10μl）：pet22b酶切产物（50ng/μl）1μl，ef-tu酶切产物5ul（50ng），5×t4bufeer2μl，t4dna连接酶（promega公司）1ul。加去离子水至终体积为20μl。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌e.colitrans5α（全式金公司），挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送上海生物工程公司测序，得到构建的原核表达载体pet-22bt7。
将所获得的阳性克隆转入e.colibl21（全式金公司），培养基选用氨苄抗性lb平板。
挑取单菌落以lb液体培养过夜，1:100(v/v)转接入新鲜液体lb培养基，37℃振荡培养至od600约等于0.6～0.8时加0.1mmiptg，在16℃的条件下诱导24h，继续培养4h；
在4℃的条件下，8000r/min离心20min，弃上清，菌体沉淀用1×pbs重悬，并进行超声波破碎，采用300hz，破碎5s，间歇5s，总破碎时间为30min。然后在4℃的条件下，12000r/min，离心10min，收集沉淀和上清，并进行sds-page电泳检查蛋白表达情况。
1.2flgt蛋白纯化与复性
获得的目的蛋白flgt是以包涵体沉淀的形式存在，将包涵体进行纯化及复性，具体操作如下：
（1）包涵体的洗涤：将离心后得到的包涵体沉淀重悬于洗涤缓冲液i中，充分振荡，混合均匀后于室温的条件下静置10min，然后在4℃条件下，10000r/min，离心20min，分别收集上清和沉淀。将所得沉淀重悬于洗涤缓冲液ii中，充分振荡，混合均匀后在室温的条件下静置10min，然后在4℃低温条件下，10000r/min，离心20min，分别收集上清和沉淀。将沉淀再以洗涤缓冲液iii进行重悬，充分振荡，混合均匀后室温静置10min，之后在4℃的低温条件下，10000r/min，离心20min，分别收集上清和沉淀；
（2）包涵体的溶解：用溶解液溶解（1）中最后收集得到的沉淀，室温条件下静置2h，其间不断充分的振荡混合，之后在4℃条件下，10000r/min，离心20min，再次收集上清和沉淀；
（3）包涵体的复性：将（2）中已经溶解并离心后的上清装入经过纯水煮沸30min并经过洗涤的透析袋中，分别置于复性缓冲液i-vi中，在4℃条件下进行梯度透析，每隔4h更换缓冲液，并在透析期间缓慢振荡复性缓冲液。透析后所得的可溶性蛋白溶液在4℃条件下，10000r/min，离心20min，收集上清和沉淀，并进行sds-page电泳检查蛋白纯度及包涵体复性情况，将复性后蛋白用蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。最后用0.25μm滤膜进行过滤除菌，获得纯化的flgt重组蛋白，即免疫抗原，并小量分装于-80℃保存备用。
所需试剂配制方法如下：
洗涤缓冲液i：tris-cl（ph8.0）50mm，nacl100mm，edta（ph8.0）10mm，tritonx-1000.5%；
洗涤缓冲液ii：tris-cl（ph8.0）50mm，nacl100mm，edta（ph8.0）10mm，tritonx-1000.5%，尿素2m；
洗涤缓冲液iii：tris-cl（ph8.0）50mm，nacl100mm，edta（ph8.0）10mm，tritonx-1000.5%，尿素4m；
包涵体溶解：tris-cl（ph8.0）50mm，nacl100mm，edta（ph8.0）10mm，tritonx-1000.5%，尿素8m，dtt5mm；
复性缓冲液i：edta（ph8.0）1mm，1×pbs（ph8.0），尿素4.5m；
复性缓冲液ii：edta（ph8.0）1mm，1×pbs（ph8.0），尿素3.5m；
复性缓冲液iii：edta（ph8.0）1mm，1×pbs（ph8.0），尿素2.5m；
复性缓冲液iv：edta（ph8.0）1mm，1×pbs（ph8.0），尿素1.5m；
复性缓冲液v：edta（ph8.0）1mm，1×pbs（ph8.0），尿素0.5m；
复性缓冲液vi：1×pbs（ph8.0），edta（ph8.0）1mm。
2．免疫小鼠
用所得到的重组灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt作为抗原免疫6~8周龄balb/c小鼠，共免疫4次，每次免疫剂量为50μg/只，具体免疫程序如下：
2.1基础免疫，灿烂弧菌flgt与弗氏完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
2.2两周后第一次加强免疫，灿烂弧菌与弗氏不完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
2.3三周后第二次加强免疫，灿烂弧菌与弗氏不完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
2.4四周后第三次加强免疫，采用腹腔注射方式，无佐剂；
2.5第三次加强免疫后的第3天，将小鼠脱颈椎处死，取脾脏用于细胞融合。
3．杂交瘤细胞株的制备及筛选
3.1骨髓瘤细胞的准备
将sp2/0骨髓瘤细胞从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中迅速摇晃，使其融化并充分混匀，然后进行离心，1000r/min，离心3min，弃去上清，沉淀用1ml含10%胎牛血清的rpmi-1640培养液重悬，将细胞悬液完全转至24孔细胞培养板中，放入5%二氧化碳细胞培养箱，37℃条件下进行培养至细胞生长至对数期，密度约为1×105cells/ml，依据细胞状态，每18-24小时对细胞进行1:1稀释分孔传代。
融合前将4孔细胞充分吹打，转至25cm2细胞培养瓶中扩大培养，24小时后更换新鲜培养基，继续培养24小时，此时观察细胞状态，若大小均一，饱满透亮，即可用于细胞融合。取4瓶细胞状态好的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，弃去瓶中的培养液，加入rpmi-1640基础培养液用弯头吸管将瓶壁上的细胞充分吹落，制成细胞悬液。
3.2细胞融合
取3-4周龄未免疫balb/c小鼠，脱颈致死，放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min后，放入超净工作台，无菌摘取胸腺，置于200目双层不锈钢网上进行研磨，并加入rpmi-1640基础培养液，收集胸腺细胞的冲洗液。将胸腺细胞悬液进行离心，1000r/min，离心5min，弃去上清，细胞沉淀用含有20%胎牛血清和2%hat的rpmi-1640培养液重悬至40ml，轻轻吹打均匀，放于37℃含5%二氧化碳细胞培养箱中备用；
脱颈处死的免疫balb/c小鼠置于75%酒精内，浸泡消毒5min，在超净工作台内用灭过菌的眼科剪剪开小鼠的胸部皮肤，打开小鼠腹腔，无菌状态下摘取免疫小鼠脾脏，将脾脏用200目无菌不锈钢碾磨，以rpmi-1640无血清培养冲洗、重悬。收集脾细胞冲洗液，1000r/min离心5min，弃去上清以rpmi-1640无血清培养重悬，通过细胞计数，使稀释的脾细胞细胞数与sp2/0骨髓瘤细胞数量的比值介于4~5:1之间。
将准备好的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞混合于50ml无菌离心管中，以1200r/min离心8min。
在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞用50%peg1500融合，融合细胞用hat选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，co2浓度为5%的培养箱中培养，倒置相差显微镜观察杂交瘤细胞生长情况。大约两周后，取杂交瘤细胞上清液，进行检测。
3.3间接酶联免疫技术筛选灿烂弧菌杂交瘤株
（1）包被抗原：将甲醛灭活灿烂弧菌用碳酸盐缓冲液（ph=9.6）稀释至5μg/ml，加入96孔酶标板中（100μl/孔），4℃包被过夜；
（2）pbs-t（pbs含0.05%tween20）洗3次，每次5min；
（3）每孔加入200μl3%的牛血清白蛋白（pbs配）37℃封闭1h；
（4）pbs-t洗3次，每次5min；
（5）加入3.2中所得杂交瘤细胞上清夜，100μl/孔，阴性对照用骨髓瘤细胞培养上清液代替；37℃，孵育1h；
（6）pbs-t洗3次，每次5min；
（7）每孔加入100μl碱性磷酸酶（ap）标记的羊抗小鼠igg（1：3000），37℃，孵育1h；
（8）pbs-t洗3次，每次5min；
（9）每孔加入100μlpnpp发色液，暗处反应5～20min，每孔加入50μl2m的naoh，稳定3～5min，即可用405nm工作波长测定od值，计算各实验孔与阴性对照od值之比（p/n），当p/n≥2.1时该孔为阳性。
4.杂交瘤细胞克隆
采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。将阳性杂交瘤细胞用1640培养液重悬，10倍梯度稀释至102cells/ml，取1ml细胞液加入9ml培养液，混合均匀，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1ml。选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液按照步骤3.3进行检测，所得阳性孔按照上述方法再克隆2次，即得分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的杂交瘤细胞4a5（保藏号cgmccno.14311）。
灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体的制备：
取生长旺盛、形态良好的灿烂弧菌杂交瘤细胞4a5制成细胞悬液，1000r/min，离心5min，去上清，用1640细胞培养液重悬细胞，使最终细胞密度为5×106cells/ml，备用；取6~8周龄balb/c小白鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只，1周后，腹腔内注射杂交瘤细胞株4a50.5ml/只，7~10天后，见小鼠腹部明显膨大，拉颈处死小鼠，用75%乙醇浸泡5min后，放入超净工作台内，以酒精棉球消毒小鼠下腹部皮肤后，无菌条件下用注射器抽取腹水，将收集的腹水混合，置离心管离心（2000r/min，l0min），离心后收集上清，采用protein-g亲和层析法纯化收集的腹水，即抗灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体。
实验：
用本发明的抗灿烂弧菌鞭毛蛋白flgt单克隆抗体，采用3.3中方法检测灿烂弧菌(vibriosplendidus)atcc33125、灿烂弧菌(vibriosplendidus)kctc12679、灿烂弧菌(vibriosplendidus)2clm002、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)kctc2471、哈维弧菌(vibrioharveyi)atcc14126、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)kccm40513、鳗弧菌(vibrioanguillarum)kctc2711、河流弧菌(vibriofluvialis)kccm40827、创伤弧菌(vibriovulnificus)atcc2126、迟缓爱德华氏菌(edwardsiellatarda)atcc15947、希瓦氏菌(shewanellaoneidensis)kccm41821，同时以pbs为阴性对照，评价特异性及交叉反应情况，所用细菌浓度为108cells/ml。
结果显示，本发明的单克隆抗体与副溶血弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、迟缓爱德华氏菌、希瓦氏菌的反应结果均为阴性，而与3株灿烂弧菌的检测结果成阳性，说明本单克隆抗体与测试菌株无交叉反应，特异性强。