一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学、靶向药物筛选领域，具体涉及一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用。

背景技术：

机体内时刻发生着物质、能量代谢，同时伴随着各种氧化反应，于细胞中产生众多自由基分子。其中活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ros)是最重要也是研究最为透彻的一类，因此它也通常被作为氧化应激的特征分子。

ros有2种来源：一种是内源性，线粒体呼吸链氧化磷酸化过程活性氧泄漏及过氧化物酶体和被激活的炎性细胞所产生等；另一种是外源性，例如外源化合物、病原体、促炎细胞因子和重金属诱导所产生等。当细胞受到内外环境的刺激后，ros等产生增多，可能会打破机体氧化-抗氧化系统间的平衡，并最终导致氧化应激。氧化应激状态下ros等自由基分子对生物大分子的破坏作用是其造成细胞损伤的主要原因。其中，蛋白质和dna是ros攻击的主要靶标。ros的攻击会造成蛋白质结构突变或生物活性丧失、dna链断裂、dna位点突变、dna双链畸变及原癌基因、肿瘤抑制基因突变，最终导致机体产生氧化损伤。而另一方面，一定含量的ros不仅不会对机体造成损伤，更有杀灭病原体及解毒等作用。这对于缺乏获得性免疫的无脊椎动物显得尤为重要。ros在一些重要的免疫反应，如“呼吸爆发”(respiratoryburst,rb)及包裹作用(encapsulation)中均发挥关键了作用。前者通过细胞大量摄入氧气，激活体内的氧化酶，使体内产生高浓度的超氧阴离子并生成多种活性氧中间体，进而利用它们杀灭细菌；后者则是血细胞结合大的入侵物，如寄生生物、原生生物及线虫等，并在入侵物周围形成多层的囊腔，随后囊腔内入侵物被腔内的ros和活性氮(reactivenitrogenspecies,rns)等毒杀或窒息而死。因此，机体氧化-抗氧化的系统之间平衡对于真核生物正常生理活动乃至生存至关重要。

由于ros对细胞正负两方面的不同效应与其浓度密切相关，因此机体氧化-抗氧化系统需要精确调控以保持平衡。氧化应激打破细胞内氧化还原状态的平衡，从而激活或抑制许多信号通路和一些信号转导分子，如nrf2-keap1通路、nf-κb通路、mapks、激酶蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mtor)和蛋白激酶c(proteinkinasec,pkc)等，最终调节效应因子基因的表达。nrf2是氧化应激响应核心通路nrf2-keap1的转录因子，存在于生物体各类细胞中。它的缺失或激活障碍直接引起细胞对应激源的敏感性变化。该通路另一重要蛋白keap1通过与nrf2中富含半胱氨酸的区域结合而使后者绝大部分无法进入细胞核，从而基本抑制nrf2的转录因子活性，避免引起细胞对应激源的敏感性升高。当细胞发生氧化应激或胞内ros浓度过高时，keap1中的半胱氨酸发生酸磷酸化，随后keap1作为e3连接酶的活性变弱，nrf2和keap1分离，导致nrf2泛素化和降解减少，细胞质中自由的nrf2增多，随之转移进细胞核的nrf2亦增多。进入细胞核的nrf2与maf蛋白形成异源二聚体，并结合到靶基因启动子区的抗氧化反应元件(antioxidantresponsiveelement,are)。随后，含有nrf2-maf二聚体的转录起始复合物激活并启动细胞中众多的抗氧化应激效应基因，如谷胱甘肽还原酶家族基因(glutathionereductasefamilygene)基因、氧硫还蛋白系统(thioredoxinsystemgene)及过氧化物酶家族基因(peroxidasefamilygene)等效应因子基因的转录，进而维持细胞内氧化-抗氧化体系的平衡[12]。

事实上，生理条件下nrf2-keap1通路能维持低强度的活性，以将代谢过程产生的ros稳定控制在一定水平。nrf2-keap1通路不仅直接参与抗氧化基因的调控，而且还可通过协调指挥其他抗氧化应激相关通路，如pi3k-akt通路及tlr通路等，共同维持细胞内部氧化-抗氧化系统的平衡。另外，rns[包括一氧化氮(no)、过氧化亚硝酰阴离子(onoo-)、亚硝酰氢(hno)、亚硝酸根离子(no2-)和二氧化氮(no2)]及外源物引起的内质网应激[(endoplasmicreticulumstress,er)-stress]亦可激活nrf2-keap1通路。可见，nrf2-keap1通路是细胞内维持氧化-抗氧化系统平衡的核心信号通路。可见，nrf2-keap1通路调控化合物无论在理论研究或运用实践方面都有重要作用。nrf2-keap1通路调控化合物的筛选涉及到该通路的活性检测。该通路活性最直接的检测方法是检测nrf2的入核情况，这通常需采用western-blot技术或免疫荧光技术。

然而如果采用上述两种技术均无法进行大规模的筛选。另一技术路线则是检测nrf2-keap1通路下游基因的表达情况，则可以采用报告基因技术实现高通量的筛选

目前，还未有关于基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选方法的报道。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用。

本发明第一方面提供了一种用于筛选抗氧化化合物的序列，可被nrf2蛋白特异性识别，所述序列包括：

1)seqidno.4所示核苷酸序列；

2)与seqidno.4所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

具体地，seqidno.4的序列为tgcaaagtcac。

本发明实施例中，“互补”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型形成一个或多个氢键。本发明实施例中，“互补”具有不同的互补百分比，包括“完全互补”或“基本上互补”。

“互补百分比”表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度。

本发明一优选实施例中，所述序列包括：

1)seqidno.3所示核苷酸序列；

2)与seqidno.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明一实施例中，所述nrf2蛋白的氨基酸编码序列为seqidno.8所示，或与其同源性不低于50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或99.9％的同源序列。

本发明第二方面提供了一种载体，所述载体包括第一方面所述的序列；

本发明一实施例中，所述载体为质粒载体。

本发明一优选实施例中，第一方面所述的序列插入所述质粒载体的多克隆位点。

更优选的实施例中，所述载体为质粒载体pgl3-basic，第一方面所述的序列插入所述pgl3-basic载体的kpni和bglii位点之间。

本发明一实施例中，所述载体为病毒载体。

在本发明实施方式中，术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括dna、rna、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。可选地，一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的dna片段的环状双链dna环。可选地，另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的dna或rna序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组dna技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。

通常，在载体内，“可操作地连接”旨在表示核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至一个或多个调节元件(可选地，载体处于一种体外转录/翻译系统中可以表达该核苷酸序列；可选地，当该载体被引入到宿主细胞中时可以表达该核苷酸序列)。

在本发明实施方式中，术语“表达”是指从dna模板转录成多核苷酸(如转录成mrna或其他rna转录物)的过程和/或转录的mrna随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组dna，表达可以包括真核细胞中mrna的剪接。

本发明第三方面提供了一种宿主细胞，包括第一方面提供的序列、第二方面所述的载体中的一种或多种。

本发明第四方面提供了一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选方法，所述方法包括:

a)将表达对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的载体和表达nrf2蛋白的载体，与内参载体共转染宿主细胞，之后加入待筛选化合物；其中，表达对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的载体为第二方面所述的载体；

b)同时设置对照组；

检测并比较a)组相对于b)组的双荧光素酶活性变化，筛选能调节lvgst活性的待筛选化合物，即为抗氧化化合物。

本发明一实施例中，所述宿主细胞为s2细胞。

本发明一实施例中，所述载体为pgl3-basic。

本发明一实施例中，所述内参载体为prl-tk质粒。

本发明第五方面提供了一种检测试剂盒，包含第一方面提供的序列、第二方面提供的载体、第三方面提供的宿主细胞中的一种或多种。

本发明一实施方式中，所述试剂盒还包括常规配套的反应试剂和/或反应设备。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris缓冲液、mops缓冲液、hepes缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的ph。

本发明所述试剂盒中的各组分可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子、管或纸板。

本发明一实施方式中，所述第五方面提供了的试剂盒还包括：pcr扩增、酶切反应、双荧光素酶检测试剂中的一种或多种试剂。

本发明第六方面提供了一种如第一方面所述序列、第二方面提供的载体、第三方面提供的宿主细胞、第四方面提供的方法、第五方面提供的试剂盒在筛选调节lvgst活性的转录因子、筛选抗氧化化合物、制备防治氧化应激引起的疾病的药物中的应用。

第七方面，本发明提供了一种mc2和/或mc3在调节lvgst活性、调控nrf2-keap1通路或制备防治氧化应激引起的疾病的药物中的应用，

其中，mc2的化学结构为：mc3的化学结构为：

本发明有益效果：

(1)本发明提供的技术方案利用双荧光素酶报告基因系统，可实现半自动化、可简便、高通量的对候选化合物进行大规模的筛选。

(2)本发明采用的双荧光素酶报告基因系统的合理设计减少了由于实验操作过程、转染效率和细胞状态差异引起的实验误差，使得准确准确性更高。

(3)本发明提供的技术方案主要运用于nrf2-keap1通路调控化合物的筛选，也用于辅助氧化应激相关疾病治疗药物的筛选。

可以理解的是，nrf2-keap1通路在真核细胞中具有保守性，故所筛选到的nrf2-keap1通路调控化合物亦可能在其他真核细胞中发挥作用。nrf2-keap1通路调控化合物对于细胞抗氧化应激功能研究有重要作用，对氧化应激引起的疾病有潜在治疗作用。因此，本发明第六方面提供了一种如第一方面所述序列、第二方面提供的载体、第三方面提供的宿主细胞、第四方面提供的方法、第五方面提供的试剂盒可用于制备防治氧化应激引起的疾病的药物中的应用。

说明书附图

图1为本发明实施例提供的lvgst是否为凡纳滨对虾nrf2-keap1通路下游靶基因的验证结果；

图2为本发明实施例提供的利用荧光素酶报告基因系统筛选凡纳滨对虾gst启动子调控化合物的结果。

图3为本发明实施例提供的lvgst是否为凡纳滨对虾nrf2-keap1通路下游靶基因的验证结果。

图4为利用荧光素酶报告基因系统筛选凡纳滨对虾gst启动子调控化合物的结果。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

若无特别说明，本发明实施例中所用试剂及耗材均为市售商品。

除非另有说明，本发明实施例采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna的常规技术，均在本领域的技能之内。包括但不限于参见如下文献：萨姆布鲁克(sambrook)、弗里奇(fritsch)和马尼亚蒂斯(maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.奥苏贝尔(f.m.ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(methodsinenzymology)系列(学术出版公司)：《pcr2:实用方法》(pcr2:apracticalapproach)(m.j.麦克弗森(m.j.macpherson)、b.d.黑姆斯(b.d.hames)和g.r.泰勒(g.r.taylor)编辑(1995))、哈洛(harlow)和拉内(lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(antibodies,alaboratorymanual)，以及《动物细胞培养》(animalcellculture)(r.i.弗雷谢尼(r.i.freshney)编辑(1987))。

本发明一具体实施方式中，本发明提供了一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用。包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：

一、染色体步移获得lvgst的启动子序列

(1)通过染色体步移的方法获得凡纳滨对虾lvgst的启动子序列，并利用pgl3-basic(货号：e1751，promega)构建报告基因载体pgl3-lvgst。根据genbank上的lvgst表达序列标签(est)序列(genbank序列号：getz01007636)，设计两个用于genome-walkingpcr的特异性引物(r1：5’ttgacgctgtggaaggaaacgaagtgca3’(seqidno.1)；r2：5’ctgtgatcaaagtgtctttcccttgaaa3’(seqidno.2)，利用genome-walkingkit进行pcr获得lvgst的启动子序列(seqidno.3)，genome-walkingkit采用的是clontech公司的试剂盒，货号：638904；(具体地，染色体步移方法包括：切割基因组，然后连接通用的接头；在扩增启动子时，正向引物采用的是试剂盒中的通用引物，反向引物为本发明实施例设计的seqidno.1和2。

seqidno.3具体为：

atatataaacgaatgggagtaagtaataaagctacaacgaaggaagagcagtggaagacagcggtgcctcttgagtggagagtcaaggtcagaattcccttcccctgatgctgacgtcatgatcacaagcgggccgtgtgaaaatggctcgcctgtcaaagtcgtatggacagaatgtaatgagtgtctgtctgttctcttgggatagtgattttgttgtttatgtttctttctacttgcctgtgtacaccgtgtctgcagactacattagagcgtgcgtgtacgcggttatctgatgtttgtgcttccgtgtgcaaagtcaccctgacatggctagctattatcagtagacttcagtcaacggtcggacgtgctctgccccacacgcccatcagcgcctcctccgaaatagtgagtggaagattcatttactggctgttctgaggctttcaagggaaagacactttgatcacaggcatactctgaacacagcttgcacttcgtttccttccacagcgtcaag。

其中，下划线为are序列，为潜在的nrf2结合位点，具体为tgcaaagtcac(seqidno.4)。

二、构建pgl3-lvgst载体：

根据步骤(一)获得的凡纳滨对虾gst基因的启动子序列(见seqidno.3)，对其进行分析并设计引物构建双荧光素酶报告基因载体；

设计合成扩增lvgst启动子的引物具体为：

pgl3-lvgst-kpni-f：tatggtaccatatataaacgaatgggagtaagtaat(seqidno.5)

pgl3-lvgst-bglii-r：aatagatctcttgacgctgtggaaggaaa(seqidno.6)

50μlpcr反应体系加样参数:正反引物各1μl(10pm)，10mmdntp1μl，10×pcrbuffer5μl，lataq酶1μl，凡纳滨对虾基因组模板200ng，以超纯水补足至50μl。

pcr运行程序参数：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；重复循环34次。

pcr产物胶回收纯化之后，利用限制性内切酶kpni和bglii分别切割pcr产物和pgl3-basic空载体(promega,e1751，质粒图谱如图1所示)各1μg。

酶切体系(50μl):10×酶切缓冲液体5μl，两种限制性内切酶各5μl，dna1μg(体积视浓度而定)，加纯水补足至少50μl。酶切温度37℃，酶切时间2小时。

空载体和pcr片段酶切完成之后，进行克隆、测序，确定载体成功构建，测序完全正确的重组载体命名为pgl3-lvgst；提取无内毒素质粒、测浓度，适当条件下保存待用。

三、检测nrf2对lvgst启动子的激活作用

1)将步骤(二)获得的pgl3-lvgst，连同pac5.1-lvnrf2(阴性对照组采用pac5.1-lvactin；pac5.1-lvnrf2以及pac5.1-lvactin为在pac5.1-basic质粒的kpnⅰ和apaⅰ酶切位点插入lvnrf2及lvactin的编码核苷酸序列所得，其中，pac5.1-basic的厂家及货号为(v4110-20)及内参质粒prl-tk(promega,e2241，质粒图谱如图2所示)共转染s2细胞。

本发明实施例所采用的lvnrf2核苷酸序列为如下seqidno.7所示：

atggaaggccctgtaattgaagaactccctgttatgaggagtttgtctccatcgaccgtgttcggggaacctatagagatcgacttcagtcaaacgctaatacaagatccatcgaaagttgtccaaattactcctagccaaatgtccgtttcttccccggaaaaatcaaggaaaaggaagaaacagtcgaaaaaagaccttgccttgattgaagccctgtggaagcaagatgttgacctgggagtccctcgtgaagtcttcgaagaggatggtttggagcccccagttgactcccagaccaaggacaaggaccatggcaagaatcccaagagtgagacaaagattgatgagaagcctgatgaaaacccatggatgcatttcaacttcactatcgactctgagactggtgagcacctcctctccacggaaagccccatcagcggcggtgacgtgaccctcgaccccgtgtctcccctgtcgcccccctccttcaccctcaacgagtcggtgccggacttcaacctcgagttcaatctcgatgaagcactcaagcttgtagggctcaattcctcggagacaggagaagcagtctggaaatctgtggagacagatagcagttctgaggacttcgccaaaggattctcggaggaagagaaggccagcgacggaggcgactccctagacgcgctgagcgacaccctggacgaaatgatccaggcttcgcagctcaacccgcaccacccgcgatcgttacagggtcggctgggcagcctggtccggagcggggaaatggagcggtggcaggaggtggtgcagtacctagggctgcccaacccccaccacacccaggcgccgcacacgcccatggccgcccacagtgcctcgcccacccacgctcatgggcacggaccccctctccaccacccgcacgccctctatcctccccacgacgcctccaccgccacgcccgcggcgcccgtgcccaggggcgtcctcctcaacaacgccacgttaccgccgcccatgtcagaccccatgagccacaacatcacatacaccaacagtatgggagcttcgagccacttggtgactaccagtatgaacctgactaacaattcagaccttgctggcagtgaccaaaaccagtacaagatggaggccaacacctcactgccctccgaaatgatgtattaccagaatacaagtacggagatgaatcagacgactgatggtctcttgtcctccatcctcaatgatgaagctttgggcttgatggaaatggccatgaatgactccggttgcgtgctgcctcagcttggtggtgaggaaggtgtggacgcctccagtgactcagcagtatcctccctcagtcctgatgaaacctggggcacagtggaccacactacacgaccccaagacaatggcagtcgaaaccagagtggagactacagtgcaggaagctatcgctatggacctgaggatcctcacagaatgccaccagtaccattgaaaaagcaacacatgtttggcagagacaagagatactttcatgataacctacaaggagcaactggtggcatgggaggtggcagcagtgcaggtgttggagatgttggaggctatggaggccattaccctccacctggcatccaaaccatggagggagccactgccttggatcctgccgagatgaagtattcttgcacaatggacttccgttcccaaggagaggtgtcagggtcaggagtggaacatgttcagcacaaccacacataccacatgtcccctgaggggccatcgggtatgtcacgcccaacatcaagagacaaacaaaaaaatcggaagaatgagcatgaccgggcactcacaagagatgagaagcgagccagagcgatgaacctgccaatctcctgtgaggacatcatcaacctccccatggatgagttcaatgagcggatctccaaatacgacctaactgaggcacagctttctcttatccgagacatccgacggcgtggcaagaacaaggttgctgctcaaaattgtcgtaaacggaagctggatcaaatccttcacttagcagatgaagtgaaagccattcagaatcgcaaaaatgagctgtacaatgagtatgaatacttgagctcagaacgaacccgtattaaacacaagttctcactattgtaccgacacatattccagagtctgcgtgatcctgatggcaatccatactctccacatgaatattcactgcagcagtctgctgacgggagtatcttgttggtccctcgctcctccactgctcaaggcatggacccaagctccagtaacaaaccaagagggaaggatgaccccaagcagtga(seqidno.7)。

seqidno.7编码的氨基酸序列为seqidno.8。

可以理解的是，在核苷酸序列编码的nrf2功能活性不受影响的前提下，本领域技术人员在seqidno.7的基础上变化部分碱基，常见的，比如seqidno.7的同源序列。

2)转染48小时后，裂解细胞，检测细胞裂解液的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值，与过表达lvactin的对照组相比较，检测nrf2对lvgst启动子的激活作用，结果表明，lvgst为nrf2-keap1通路下游效应基因，结果如图3所示，图3为本发明实施例提供的lvgst是否为凡纳滨对虾nrf2-keap1通路下游靶基因的验证结果。由图3可知，凡纳滨对虾nrf2显著增强lvgst启动活性，而当lvgst启动子中的nrf2结合位点发生突变(pgl3-lvgstm)则这种促进作用消失。采用单因素方差分析，**表示p＜0.01。相对于pgl3-lvgst，图2中pglbasic和pgl3-lvgstm的差别在于are位点序列，具体地，are位点序列信息为：pgl3-lvgst为tgcaaagtcac，pgl3-lvgstm为：gaagcctcaga。

四、利用荧光素酶报告基因系统筛选候选化合物

将步骤(二)构建的报告基因质粒pgl3-lvgst和内参质粒共转染共转染s2细胞。转染40小时后，分别加入候选化合物。8小时后，裂解细胞，检测细胞裂解液中的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值，与对照组比较，分析候化合物对lvgst启动子的调控作用。

提前一天于96孔板中培养s2细胞(schneider'smedium培养基+5％fbs)，待细胞长至覆盖90％左右(约24小时)的面积时进行质粒转染。

96孔板的每孔的转染体系中(50μl)含pgl3-lvgst0.2μg,pac5.1-lvnrf20.3μg，prl-tk0.02μg；转染试剂采用lipofectamine2000(invitrogen,货号：11668-027),转染方法按照试剂说明书。

在转染40小时之后，在不同的实验组培养基中加入适量nrf2-keap1通路激活剂叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tbhq)、nrf2-keap1通路抑制剂ly294002(结构式c19h17no3分子量：307.343，cas号：154447-36-6)、keap1-nrf2通路抑制因子keap1(comp124453)或是候选化合物进行处理；8小时后，裂解细胞并分别检测裂解液中的荧火虫荧光素酶/海肾荧素酶活性的比值。细胞裂解和荧光素酶活性检测采用dual-luciferasereporteraassaysystem(promega,货号327451),使用方法按照试剂说明书。与未加入候选小分子调控剂的对照组相比较，确定各候选化合物对lvgst启动子活性的影响。

通过对海洋化合物mc1-7的筛选，发现mc2及mc3能够显著调lvgst的活性，是nrf2-keap1通路潜在的调控因子，可继续深入研究。

其中，mc2的化学结构为：mc3的化学结构为：

图4为利用荧光素酶报告基因系统筛选凡纳滨对虾gst启动子调控化合物的结果。通过检测发现，海洋化合物(marinecompound,mc)mc2及mc3能够显著调lvgst的活性。这表明它们是nrf2-keap1通路潜在的调控因子。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。

五、调控化合物的免疫验证

对于能显著激活lvgst的调控化合物，利用其处理s2细胞，再利用果蝇nrf2抗体检测其能否诱导nrf2入核，即激活nrf2-keap1通路。

本领域技术人员可以理解的是，在知晓本发明记载的有效的gst启动子及gst启动子nrf2结合序列的前提下，本领域技术人员可以采用本领域常规的替代方法替换本发明实施例中常规的基因的扩增、重组表达载体的构建、检测nrf2对启动子的激活等步骤中的一种或多种，以期获得类似或等同的效果。

本领域技术人员可以理解的是，在知晓本发明记载的有效的gst启动子及gst启动子nrf2结合序列的前提下，本领域技术人员采用本发明步骤(四)记载的方法筛选nrf2-keap1通路潜在的调控化合物应纳入本发明保护范围，同理，本领域技术人员可以理解的是，类似或等同的替换应纳入本发明保护范围。

序列表

<110>中山大学

<120>一种基于对虾谷胱甘肽还原酶基因启动子的抗氧化化合物的筛选质粒、筛选方法及应用

<141>2017-09-06

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物序列

<400>1

ttgacgctgtggaaggaaacgaagtgca28

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(28)

<223>引物序列

<400>2

ctgtgatcaaagtgtctttcccttgaaa28

<210>3

<211>523

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(523)

<223>lvgst的启动子序列

<400>3

atatataaacgaatgggagtaagtaataaagctacaacgaaggaagagcagtggaagaca60

gcggtgcctcttgagtggagagtcaaggtcagaattcccttcccctgatgctgacgtcat120

gatcacaagcgggccgtgtgaaaatggctcgcctgtcaaagtcgtatggacagaatgtaa180

tgagtgtctgtctgttctcttgggatagtgattttgttgtttatgtttctttctacttgc240

ctgtgtacaccgtgtctgcagactacattagagcgtgcgtgtacgcggttatctgatgtt300

tgtgcttccgtgtgcaaagtcaccctgacatggctagctattatcagtagacttcagtca360

acggtcggacgtgctctgccccacacgcccatcagcgcctcctccgaaatagtgagtgga420

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<220>

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<222>(1)..(11)

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<220>

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<222>(1)..(29)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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leuileglyalaproserleuvalvalglyilethrproserglymet

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servalserserproglyleuseralaleualaleuleuglyserleu

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leualaleualaleuileglyalaleuthrleuglyalavalalaleu

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100105110

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130135140

proileserglyglyalavalthrleualaprovalserproleuser

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180185190

thrglyglyalavalthrleuservalglythralasersersergly

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alaproalaleuglyproserglyglyglyleualaseralaglygly

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alaserleualaalaleuseralathrleualaglymetileglyala

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glyseralaalaglyserileleuleuvalproalaserserthrala

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proleugly

785