本发明涉及用于表达生长因子fc融合蛋白的表达载体和细胞，具体地，本发明涉及含有人神经生长因子fc融合蛋白的重组载体及重组细胞，本发明还涉及所述重组细胞的制备方法、重组人β-ngf-fc融合蛋白的纯化方法及所述重组载体和重组细胞用于制备重组人β-ngf-fc融合蛋白的用途。
背景技术：
神经生长因子(nevergrowthfactor，ngf)是levi-montalcini于1953在小鼠肉瘤细胞中发现的一种神经营养因子。随后，cohen从蛇毒及小鼠下颌腺中都分离纯化出了这种营养因子，根据它所表现出的神经营养作用，将其命名为神经生长因子。神经生长因子的发现推动了整个神经科学、细胞生物学及发育生物学的发展，为神经学科的研究开拓了新的领域。为此，levi-montalcini也于1986年被授予诺贝尔医学生理学奖。神经生长因子是迄今为止研究最早也是最为透彻的一种神经营养因子。它在调节神经元生长、发育、分化、决定轴突生长的方向、损伤神经的修复中都起到了非常重要的作用。有研究表明，ngf对维持成年的交感神经元的功能也有十分重要的意义。一些退行性的神经元性的疾病，比如阿兹海默症，亨丁顿舞蹈症等的发生和发展也与ngf的缺乏有关。除了神经系统，ngf还广泛存在于非神经系统中，比如可以促进嗜铬细胞的增殖，b淋巴细胞的抗凋亡作用，最近有研究发现，ngf在抑制肿瘤细胞的增殖方面也有明显效果。
人ngf基因位于1号染色体短臂2区2带及1号染色体短臂2区1带1号亚带上，由6个外显子及5个内含子组成。完整的ngf是由2个α亚基，2个β亚基及2个γ亚基以及锌指结构以非共价键形成的聚合体。其中α亚单位属于非匀质性酸蛋白，其pi约为4.3，它的作用主要是阻止γ亚单位对β亚单位的水解，从而对其起到保护作用。γ亚单位具有精氨酸酯肽酶活性，其主要作用与ngf的合成有关，可以将无活性的β亚基激活。β亚基是ngf的活性基团，它由两条含有118个氨基酸的肽链通过非共价建形成的二聚体。成熟的ngf链内含有6个半胱氨酸残基，可以产生3对链内二硫键[7],二硫键对维持ngf的生物学活性十分重要，一旦二硫键被破坏，ngf的是生物学活性会大大降低甚至是丧失。
神经生长因子(nevergrowthfacter)，是最早被发现的神经营养因子家族成员之一，具有促进神经元分化及存活的重要功能，在临床上被广泛应用于外周神经损伤，角膜溃疡等多种疾病。目前上市的神经生长因子主要来源于小鼠的下颌腺，存在一定的鼠源病毒污染风险。本研究应用重组表达技术，利用中国仓鼠卵巢(cho)细胞株表达人神经生长因子与igg1fc融合蛋白，不但可避免鼠源性病毒污染，而且可简化神经生长因子的纯化过程，还能增强重组蛋白的稳定性，并且有效提高神经生长因子在体内的半衰期。ngf在体内以241个氨基酸的形式构成，通常称之为preprongf前体，包含了信号肽、前导肽及成熟肽三部分。其中1-18个氨基酸为信号肽，其主要作用与蛋白质的分泌有关。在内质网中，preprongf前体的信号肽被切割下来，形成prongf前体(223个氨基酸)。prongf前体在内质网中以同源二聚体形式存在，然后转移至高尔基体中，prongf的前导肽被切除。19-104个氨基酸为前导肽，前导肽中含有两个保守区域，与促进ngf正确折叠及成熟ngf的外分泌有关。prongf经过n末端及c末端的修饰后，形成成熟的具有生物学活性的ngf，在细胞内，弗林蛋白酶可以特异性识别prongf中的arg-ser-lys-arg位点，切除前导肽，使prongf转变成为成熟的ngf。研究表明，prongf不具有生物学活性，只有经过酶切后暴露出自由n端的ngf才能与受体特异性结合，从而发挥生物学活性。
目前上市的神经生长因子主要来源于小鼠的下颌腺，存在一定的鼠源病毒污染风险。本研究应用重组表达技术，利用中国仓鼠卵巢(cho)细胞株表达人神经生长因子与igg1fc融合蛋白，不但可避免鼠源性病毒污染，而且可简化神经生长因子的纯化过程，还能增强重组蛋白的稳定性，并且有效提高神经生长因子在体内的半衰期。
本发明分别构建了三个重组表达质粒，分别为野生型ngf基因与fc段基因进行融合，经过密码子优化的ngf基因与fc段基因进行融合以及ngf末端缺失9个碱基序列的基因与fc段基因进行融合。
通过脂质体转染将重组表达载体分别转染至cho-s细胞，经westernblot、elisa及鸡胚背根神经节实验证实，三株转基因细胞均可表达大小正确且具有较好生物学活性的重组人β-ngf-fc融合蛋白。
利用甲氨蝶呤和嘌呤霉素进行了两个阶段的压力筛选，证明经密码子优化的ngf细胞株其表达量明显高于其余两株细胞。后续通过有限稀释法进行单克隆筛选，并最终获得一株可高效表达重组人β-ngf-fc融合蛋白的cho细胞株。将该株细胞扩大培养至1l，收集所有细胞上清，利用rproteina亲和层析对目的蛋白进行纯化。经bca蛋白定量法测定，本次纯化共获得目的蛋白23.45mg。对纯化所得到的融合蛋白进行了还原sds-page电泳后发现分别在50kd及60kd处可见到两个蛋白条带，分别用westernblot及n-末端氨基酸序列测定的方法对两处蛋白条带进行了鉴定发现50kd处的蛋白条带的氨基酸序列为ssshpifhrgefsvc，与ngf前15个氨基酸序列完全一致，而60kd处的蛋白条带的氨基酸序列为ephsesnvpaghtipq，与ngf前体prongf前15个氨基酸序列一致，证明该处条带为未经过furin蛋白酶酶切的prongf-fc融合蛋白。于是我们利用furin蛋白酶在体外对融合蛋白再次酶切，经westernblot结果证实prongf前体被切掉，得到了单一的目的条带。
将纯化所得到的β-ngf-fc融合蛋白进行理化及生物学活性的检定：非还原sds-page电泳测定融合蛋白的纯度为93.39％；还原sds-page电泳测得融合蛋白分子47.65kd；融合蛋白能与鼠抗人ngf单克隆抗体特异性结合；经紫外扫描融合蛋白在280nm处有最大吸收峰；等电聚焦电泳测得融合蛋白等电点为4.55～5.85；n-末端氨基酸序列测定融合蛋白n端15个氨基酸序列ssshpifhrgefsvc；质谱测定分子量结果为40917.20da，与理论分子量40917.49da相对误差为0.0007％；利用胰蛋白酶将融合蛋白酶解后进行了质谱鉴定，共得到22个与目的蛋白相匹配的肽段，氨基酸覆盖率为77％；鸡胚背根神经节法测定furin酶切后融合蛋白的比活为1.04×105au/mg,未经过furin酶切的融合蛋白的比活为6.54×104au/mg；tf-1细胞/mts法测定furin酶切后融合蛋白的比活为1.84×105u/mg；未经过furin酶切的融合蛋白的比活为1.07×105u/mg.经检测细胞株支原体为阴性，内外病毒因子阴性，可稳定传代至45代且保持表达量不变。
技术实现要素：
本发明的目的是获得含有神经生长因子fc融合蛋白基因的核苷酸序列的重组载体，构建出能够分泌表达重组人β-ngf-fc融合蛋白的cho-s细胞株，以及提供重组细胞和β-ngf-fc融合蛋白的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：重组载体，其特征在于：其含有神经生长因子fc融合蛋白基因的核苷酸序列；所述的神经生长因子fc融合蛋白基因的核酸序列为：pcho1.0-beta-ngf-fc(pcho1.0-β-ngf-fc表达载体)如seqidno：1所示，或pcho1.0-beta-ngf-opt-fc(pcho1.0-β-ngf△opt–fc表达载体)如seqidno：2所示，或pcho1.0-beta-ngf-rra-fc(pcho1.0-β-ngf△rra-fc)如seqidno：3所示，所述载体为freedomtmpcho1.0。
重组细胞，其特征在于：其含有权利要求1所述的重组载体；所述重组细胞为分泌表达重组人β-ngf-fc融合蛋白的cho-s细胞株。cho-s细胞株在cdforticho无血清培养基中常规培养。其为经过氨甲喋呤和嘌呤霉素加压筛选培养后的细胞。
所述加压筛选为两个阶段的加压筛选：第一阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为0～120nm；第二阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为50～1000nm；
所述第一阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为0～1.2μg/ml；第二阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为0～30μg/ml。
β-ngf-fc融合蛋白，由上述重组载体或重组细胞制备得到。
上述重组载体或重组细胞用于制备或生产β-ngf-fc融合蛋白的用途。
上述重组细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将权利要求1的重组载体转染入cho细胞中，在含有无血清培养基的细胞培养瓶中静止培养10～14天(例如12天)，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为0～120nm，嘌呤霉素的浓度为0～1.2μg/ml；
(2)将步骤(1)培养获得的细胞转移至摇瓶中摇动培养11～15天(例如第13天)，每3～4天传一代，培养基与步骤(1)相同；
(3)适当增加细胞密度，继续在含有无血清培养基的摇瓶中摇动培养18～25天，每3～4天传一代，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为50～1000nm，嘌呤霉素的浓度为0～30μg/ml，即获得权利要求2-6任一项的重组细胞；
(4)任选地，还包括对所获得的细胞进行单克隆筛选、以获得更高表达量的细胞株的过程。
上述β-ngf-fc融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括重组细胞的制备方法，以及培养重组细胞和收获细胞培养上清的步骤。
β-ngf-fc融合蛋白的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)培养表达β-ngf-fc融合蛋白的重组细胞，收获细胞培养上清；
2)将细胞培养上清用离子交换层析进行纯化，得到纯化后的样品；
3)将步骤2)获得的样品用分子筛层析进行纯化，得到纯化的β-ngf-fc融合蛋白；优选地，所述表达β-ngf-fc融合蛋白的重组细胞上述的重组细胞；进一步优选地，所述重组细胞是按照前述所述的重组细胞的制备方法制备得到的。
本发明成功构建了重组人β-ngf-fc融合蛋白的重组载体，成功构建了重组人β-ngf-fc融合蛋白的cho细胞株，以及具有正确序列和较高活性的重组人表皮生长因子，由此完成了本发明。
本发明成功构建了构建的3个重组质粒pcho1.0-β-ngf-fc、pcho1.0-β-ngf△opt–fc、pcho1.0-β-ngf△rra-fc。其核苷酸序列表详见seqidno：1，seqidno：2，seqidno：3。
本发明成功构建了optiprotmsfm-质粒dna混合液。
本发明成功构建了optiprotmsfm-freestlyetmmax混合液。
本发明成功构建了3种真核表达载体，分别为pcho1.0-β-ngf-fc表达载体；pcho1.0-β-ngf△opt–fc表达载体及pcho1.0-β-ngf△rra-fc表达载体，所述载体为freedomtmpcho1.0。经菌落pcr鉴定、酶切鉴定及基因测序证明重组载体构建成功。
瞬时转染cho-s细胞，经wb及elisa法鉴定，证明转染后细胞可以正确表达重组人β-ngf-fc融合蛋白，经鸡胚背根神经节法测定融合蛋白具有较好的生物学活性。利用甲氨蝶呤及嘌呤霉素进行两个阶段的压力筛选后，获得可以稳定表达重组融合蛋白的细胞株，根据蛋白产量评估结果，最终选定β-ngf△opt–fc细胞株进入单克隆筛选。在单克隆筛选阶段，铺25块96孔细胞板，经观察共得到527株单克隆细胞，筛选其中表达量最高的10株细胞扩大培养，使用elisa再次对重组蛋白产量进行评估后，选定c6#株单克隆细胞进入后续实验。
利用rproteina亲和层析共获得融合蛋白23.45mg，还原sds-page电泳显示分别在50kd及60kd处有两个蛋白条带，利用兔抗人β-ngf抗体鉴定融合蛋白成分，结果显示两处蛋白均可与兔抗人β-ngf抗体特异性结合，证明两处蛋白均为ngf相关成分。利用n-末端氨基端测序法测得50kd处条带的前15个氨基酸分别为ssshpifhrgefsvc，与人ngf前15个氨基酸序列完全一致。60kd处蛋白条带的前15个氨基酸分别为ephsesnvpaghtipq，经比对与prongf前体的前15个氨基酸完全一致，证明该处蛋白条带为ngf前体蛋白。利用furin蛋白酶在体外对融合蛋白进行切割后，获得单一的蛋白条带。
β-ngf-fc融合蛋白的分析结果如下：还原sds-page电泳测定融合蛋白分子量为47.65kd；sds-page电泳测定融合蛋白纯度为93.39％；经紫外扫描融合蛋白在280nm处有最大吸收峰，等电聚焦电泳法测定融合蛋白的等电点为4.55～5.85，n-末端氨基端测定融合蛋白的前15个氨基酸序列为：ssshpifhrgefsvc；质谱法测定融合蛋白的分子量为40917.49da；融合蛋白经胰蛋白酶酶解后进行质谱鉴定共获得22个与理论肽段相符的蛋白质片段，氨基酸覆盖率为77％；鸡胚背根神经节法测定酶切后融合蛋白的比活性为1.04×105au/mg,未经过酶切的融合蛋白的比活为6.54×104au/mg；经tf-1/mtt比色法测定酶切后融合蛋白的比活为1.84×105u/mg，未经过酶切的融合蛋白的比活为1.07×105u/mg。
本发明的有益效果是：成功构建出可以分泌表达重组人β-ngf-fc融合蛋白的cho-s细胞株，初步建立了重组融合蛋白纯化工艺，并对融合蛋白进行了理化及生物学活性分析，为今后重组人β-ngf-fc融合蛋白的研究奠定了基础。
附图说明
图1rhngf的三维结构图。
图2hngf的平面结构。
图3.ngf的信号转到途径。
图4.优化前基因评估。
图5.优化后基因评估。
图6.密码子修改比对图。
图1.1pcho1.0表达质粒示意图。
图1.2重叠pcr结果。
图1.3重组质粒pcho1.0-β-ngf-fc的菌落pcr鉴定mdl15000dnamarker1-10不同单克隆的pcr产物。
图1.4重组质粒pcho1.0-β-ngf△opt-fc的菌落pcr鉴定mdl15000dnamarker1-10不同单克隆的pcr产物。
图1.5重组质粒pcho1.0-β-ngf△rra-fc的菌落pcr鉴定m：dl15000dnamarker1-10：不同单克隆的pcr产物。
图1.6avrii和bstz171双酶切鉴定。
图2.1β-ngf及igg-fc的表达验证。
图2.2ngf含量标准曲线。
图2.3鸡胚背根神经节测得融合蛋白活性figure2.3dorsalrootgangliameasuredtheactivityofthefusionproteinstandard1～5依次为：3au/ml标准品、1au/ml标准品、0.33au/ml标准品、0.11au/ml标准品、0.03au/ml标准品；空白对照为转染空载体后48小时细胞上清；β-ngf-fc1～5依次为：稀释45倍细胞上清、稀释135倍细胞上清、稀405释倍细胞上清、稀释1215倍细胞上清、稀释3645倍细胞上清；β-ngf△rra-fc依次为：稀释50倍细胞上清、稀释150倍细胞上清、稀释450倍细胞上清、稀释1350倍细胞上清、稀释4050倍细胞上清；β-ngf△opt–fc1～5依次为：稀释70倍细胞上清、稀释210倍细胞上清、稀释630倍细胞上清、稀释1890倍细胞上清、稀释5670倍细胞上清。
图2.4第一阶段压力筛选细胞活力示意图。
图2.5细胞生长示意图。
图2.6蛋白产量示意图。
图2.7不同克隆表达量比较。
图3.1rproteina亲和层析图。
图3.2亲和纯化产物的还原sds-page电泳图figure3.2reducingsds-pageelectrophoresisaffinitypurificationproductm为蛋白质marker，1～11号样品分别为1号、5号、10号、15号、20号、25号、30号、35号、40号、43号样品
图3.3bca测定蛋白浓度标准曲线。
图3.4纯化产物的westernblot鉴定figure3.4westernblotidentificationofthepurifiedproductm:蛋白质marker；1～4：β-ngf-fc融合蛋白样品。
图3.550kd处蛋白条带n末端测序结果figure3.5n-terminalsequencingresultsof50kdproteinbands。
图3.6为60kd处蛋白条带n末端测序结果，测得的氨基酸序列为：1.glu；2.pro；3.his；4.ser；5.glu；6.ser；7.asn；8.val；9.pro；10.ala；11.gly；12.his；13.thr；14.ile；15.pro；经比对该处蛋白条带与prongf的前15个氨基酸序列完全一致，判断60kd处蛋白条带为prongf-fc融合蛋白。
图3.7furin蛋白酶酶切后westernblot鉴定结果figure3.7afterfurinproteasecleavagewesternblotidentificationresultsm：蛋白质marker；1:酶切前融合蛋白样品；2：furin蛋白酶酶切后融合蛋白。
图3.8紫外光谱扫描。
图3.9还原sds-page电泳测得分子量结果。
图3.10sds-page测定融合蛋白纯度。
图3.11融合蛋白等电聚焦电泳结果m：marker；1～2：β-ngf-fc融合蛋白样品。
图3.12融合蛋白的n末端氨基酸序列测定。
图3.13鉴别实验结果m：蛋白质marker；1～2：β-ngf-fc融合蛋白样品；3：mngf。
图3.14多电荷质谱图。
图3.15分子量测定结果。
图3.16融合蛋白质谱图。
图3.17鸡胚背根神经节法测定融合蛋白活性。
图3.18tf-1细胞/mts比色法测定ngf活性。
图3.19液相梯度表及曲线图。
图4.1cho-ngf-fc细胞及cho-s细胞形态对比(a、b)cho-ngf-fc细胞；(c、d)cho-s细胞。
图4.2不同代次细胞ngf表达量p5～p45：不同代次cho-ngf-fc细胞株。
图4.3实验组bhk-21细胞图片(x100)。
图4.4对照组bhk-21细胞图片(x100)。
图4.5阳性对照组。
图4.6阴性对照组。
图4.7cho-ngf-fc荧光染色实验。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
cho-s在cdforticho无血清培养基中常规培养，添加1％抗结团剂，使用时均添加8mm的谷氨酰胺。
实施例1构建重组人β-ngf-fc融合蛋白真核表达载体。
1.1主要试剂和仪器。
avrii、bstz17i限制性内切酶购自美国neb公司t4dna连接酶；购自美国neb公司dl15000、dl6000dna分子量marker购自日本takara公司；q5high-fidelitypcr试剂盒购自美国neb公司；wizareplussvminiperepsdnapurifcationsystem；购自promega公司；qiaquickgelextractionkit，购自qiage公司；lb液体培养基：蛋白胨粉末10g，酵母提取物：5g，氯化钠10g，加去离子水至1l，高压灭菌后备用；pcho1.0真核表达载体，购自gibco公司，-20℃冰箱保存；e.colidh5a感受态细胞购自transgen公司。
1.2实验方法。
1.2.1人神经生长因子，人神经生长因子优化基因及fc段基因的克隆。采用全基因合成的方法，根据genebank提供的人神经生长因子的cdna序列(genebank:nm-002506),人igg1fc段的cdna序列(genebank：nm-000586.3)及经过优化的人神经生长因子的dna序列送至中美泰合生物技术有限公司进行全基因合成。将合成的基因连接到pmd18t载体中，即得到了pmd18t-nervegowthfactor载体及pmd18t-nervegowthfactor△opt及pmd18t-igg1fc载体。采用bioedit生物学软件将合成的dna序列与目的基因序列进行对比分析。
1.2.2实验所用引物，
ngf-f5’-tgcagcctagggccaccatgtccatgttgttc-3’
igg1fc-r5’-aggacttgggctcggctcttctcaca-3’
ngf-fcm15’-aggacttgggctcggctcttctcaca-3’
ngf-fcm25’-tgtgagaagagccgagcccaagtcct-3’
ngf△rra-fcm15’-aggacttgggctccacagacttcctg-3’
ngf△rra-fcm25’-caggaagtctgtggagcccaagtcct-3’
ngf△opt-f5’-tgcagcctagggccaccatgagcatgctgttc-3’
ngf△opt–fcm15’-aggacttgggctcggcgcggcgcacggccttgc-3’
ngf△opt–fcm25’-tcctgaacccgagccgcgccgcgtgcggaacg-3’
1.2.3目的基因的获得。
1.2.3.1β-hngf-fc融合基因的获得。，
1.2.3.1.1扩增β-hngf基因
取质粒pmd18t-nervegowthfactor载体稀释100倍后，按照下述体系进行基因扩增:
反应条件：37℃水浴酶切6小时，1.0％琼脂糖凝胶，100v电压，电泳40分钟。
1.2.6.2连接反应
反应条件：16℃金属浴，连接过夜
终止反应：65℃加热10min
1.2.6.3感受态细胞dh5α的转化
从-70℃冰箱中取出dh5α感受态细胞，冰上放置10min，使其融化并加入连接产物50μl，混匀，冰上放置30min，立即与42℃水浴锅热激90s，再于冰上放置2min，加入不含任何抗生素的lb培养基800μl，37℃、150rpm培养45min。5000rpm离心2min，弃去500μl上清液，将剩余菌液均匀地涂抹在含有100μg/ml的卡那霉素的lb平板中，于37℃培养箱中倒置培养过夜。
1.2.6.4阳性克隆的挑选及菌落pcr鉴定
用细枪头挑选卡那霉素lb平板上的阳性菌落，然后在含有100μg/ml卡那霉素的液体lb选择性培养基中，37℃进行扩增，余下的菌体接种至pcr体系中，使用pcho1.0质粒通用引物对菌落进行pcr鉴定，反应体系同3.1.1。pcr反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸27s；28个循环后72℃延伸10min。经电泳鉴定后，选取pcr结果为阳性的菌落进行扩增，37℃，200rpm培养14h后进行质粒小量提取。
1.2.6.5质粒的提取
取过夜培养的菌液1ml，加入1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，小心弃去上层液体，重复上述步骤，每管加入菌液5～10ml
向留有菌体沉淀的离心管中加入bufferi(cellresuspensionsolution)溶液250μl，用移液器吹打5～10次，使菌体充分重悬
往离心管中加入250μlbufferii(celllysissolution)溶液，缓慢地上下颠倒离心管5～10次，使离心管中的菌充分裂解，此时应见到菌液变得十分粘稠
向离心管中加入蛋白酶k10μl，缓慢地上下颠倒离心管5～10次，使其充分混匀(上述3.4步骤用时最好不要超过5分钟)
向离心管中加入350μlbufferiii(neutralizationsolution)溶液，上下颠倒离心管10～20次，使溶液充分混匀，此时试管内可见明显絮状的白色沉淀。
将上述离心管放入离心机中，10000rpm，离心10分钟，将上清液用移液管小心移入吸附柱中，10000rpm，离心2分钟，弃去下层离心中溶液。
向吸附柱加入columnwashsolution500μl，静置5分钟，10000rpm，离心2分钟，弃去下次离心管中液体，重复上述步骤1次。
将吸附柱10000rpm，空转2分钟，使吸附柱中残留的columnwashsolution除去
向吸附柱中加入无菌注射用水100μl，室温静置5min，10000rpm，离心1分钟，收集质粒溶液，用微量分光光度计测定质粒浓度。
1.2.7酶切鉴定和测序
1.2.7.1质粒的酶切鉴定
将菌落pcr阳性的克隆与空载体pcho1.0进行双酶切鉴定，酶切体系如下：
反应条件：37℃水浴酶切6小时，1.0％琼脂糖凝胶，100v电压，电泳40分钟。
1.2.7.2测序
将鉴定结果为阳性的质粒送至北京中美泰合生物技术公司测序。
1.3结果
1.3.1重组质粒示意图
图1.1为表达载体pcho1.0的示意图，该载体能够表达一个基因或利用载体上面的杂交cmv启动子共表达2个目的基因。该载体包含有二氢叶酸还原酶(dhfr)选择性标记和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，可以同时使用mtx和嘌呤霉素进行筛选，该载体还含有卡那霉素抗性基因，本研究将目的基因插入avrii限制性内切酶及bstz17l限制性内切酶之间。
1.3.2重叠pcr结果
图1.2重叠pcr结果，人ngf基因的理论大小为723bp，人igg1-fc段基因的理论大小为699bp，经过密码子优化后的人ngf基因片段的理论大小也为723bp，人ngfc端缺失3个氨基酸的基因的理论大小为714bp，所以重组人β-ngf-fcβ-ngf△opt–fc和β-ngf△rra-fc融合基因片段的理论大小分别为1422bp、1422bp以及1413bp。由图1.2结果可以看出，pcr得到目的条带在1000bp及2000bp之间，与理论大小相一致。
1.3.3菌落pcr结果
图1.3重组质粒pcho1.0-β-ngf-fc的菌落pcr鉴定菌落pcr鉴定mdl15000dnamarker1-10。图1.4重组质粒pcho1.0-β-ngf△opt-fc的菌落pcr鉴定mdl15000dnamarker1-10。图1.5重组质粒pcho1.0-β-ngf△rra-fc的菌落pcr鉴定m：dl15000dnamarker1-10：不同单克隆的pcr产物。不同单克隆的pcr产物。不同单克隆的pcr产物回收的pcr产物与载体pcho1.0进行avrii、bsta17i双酶切，回收酶切产物，t4dna连接酶连接双酶切后的载体与目的基因片段，转化感受态e.colidh5α，挑选转化后的单克隆活化后，进行菌落pcr鉴定，根据菌落pcr结果，选取pcr结果阳性的克隆进行扩大培养后进行酶切鉴定。
1.3.4重组质粒的酶切鉴定
图1.6avrii和bstz171双酶切鉴定结果。对构建的3个重组质粒pcho1.0-β-ngf-fc、pcho1.0-β-ngf△opt–fc、pcho1.0-β-ngf△rra-fc分别用avrii和bstz171限制性内切酶进行了酶切鉴定，酶切产物进行了1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1.3，经过酶切后的重组载体在1500bp及13000bp左右位置可见到两个明显条带，目的条带与理论大小基本一致。而未经过改造的pcho1.0载体经过酶切后仅见到1个条带，条带大小约为13000bp。
1.3.5测序结果.
取菌落pcr及酶切鉴定结果呈阳性的重组质粒送至北京中美泰和生物技术公司测序，将测序结果与目的基因进行比对，结果证实3种重组质粒的测序结果与理论序列完全一致，序列比对图见附录。
1.4小结
成功获得了β-ngf-fc、β-ngf△opt–fc、β-ngf△rra-fc融合基因序列，经双酶切后成功将基因序列连接入pcho1.0表达载体中，经菌落pcr鉴定，酶切鉴定及测序鉴定后，正确构建了3个重组表达质粒与理论序列一致。
构建稳定表达重组人β-ngf-fc融合蛋白的细胞株。
2.1实验材料和试剂。
2.1.1主要材料和试剂；无血清培养基cdforticho，购自lifetechnologies公司；转染试剂freestlyetmmaxreagent，购自lifetechnologies公司；培养基optiprotmsfm，购自lifetechnologies公司；甲氨蝶呤，mtx，购自sigma；嘌呤霉素，puromycin，购自lifetechnologies公司；细胞冻存液，synth-a-freezacts，购自gibco公司；抗结团剂，anti-clumpingagent，购自gibco公司；谷氨酰胺，glutamine，购自gibco公司；cho-s细胞，购自购自gibco公司，由本科室(中国食品药品检定研究院重组药物室)保存；dmem培养基，购自gibco公司；t75、t24细胞培养瓶，125ml、1l三角细胞摇瓶，15ml、50ml离心管均购自corning公司；96孔、24孔、6孔细胞培养板均购自corning公司。
2.2实验方法。
2.2.1重组表达质粒瞬时转染cho-s细胞。
2.2.1.1细胞的培养、传代及冻存。
cho-s的培养及传代。
cho-s在cdforticho无血清培养基中常规培养，添加1％抗结团剂，使用125ml细胞摇瓶，130～150rpm,37℃,8％co2中培养。传代时将全部细胞悬液移至50ml离心管中，1000rpm,离心5min，然后加入cdforti培养基重悬，每次传代的密度为3×105/ml，每3～5天传一代。
cho-s的冻存与复苏
取125ml细胞摇瓶中的处于对数生长期的cho-s细胞，1000rpm，离心5min，弃去细胞上清，加入3ml细胞冻存液重悬后将细胞悬液加入细胞冻存管中，先置于-80℃冰箱中过夜，第二天转移置液氮罐中保存。细胞复苏时，从液氮罐中取出细胞，首先确定细胞名称及代次，将冻存管放入37℃温水中迅速融化，在超净台中打开冻存管，用1ml移液器将细胞悬液加入含有14ml的cdforti培养基中混匀，1000rpm，离心5min，弃去上清液，将细胞接种至75cm2细胞培养瓶中，于37℃，8％co2细胞培养箱中培养，定期观察细胞生长状况。
2.2.2去内毒素质粒大提
将含有正确质粒的菌落过夜培养200ml菌液，使用qiagenendofreeplasmidgigakit进行质粒提取。
收集过夜lb菌液，1000rpm，4℃，离心15min，加入100mlbufferp1将菌体重悬
加入100mlbufferp2，充分颠倒混匀4～6次，室温放置5min，加入100ml预冷的bufferp3，充分颠倒混匀4～6次(用力)。
将qiafiltercartridges连入螺口玻璃瓶，连接真空泵，将裂解液倒入倒入qiafiltercartridges，室温放置10min。使用真空泵使液体完全通过滤膜，加入50ml的bufferfwb2，用无菌玻璃棒轻柔搅拌沉淀，再次使用真空泵使液体完全通过滤膜。
加入20ml的bufferer到滤过液中，颠倒混匀4～6次，冰上放置30min。
用100mlbufferqbt平衡qiagen-tip，自然放置，直至液体完全进去tip，然后将5步所得的滤过液加入qiagen-tip，室温放置，使其完全进入tip中。
使用500ml的bufferqc洗涤qiagen-tip
使用35ml的bufferqn洗脱dna，再加入25ml的异丙醇沉淀dna，15000rpm,4℃，离心30min后，弃去上清
加入10ml的不含内毒素的70％乙醇洗涤dna，15000rpm，离心10min
自然干燥30min，用适合的体积的无内毒素bufferte溶解dna。
2.2.3瞬时转染
转染前细胞准备：转染前24小时，使用含有8mm谷氨酰胺的cdforticho培养基进行细胞传代，接种密度为：5×105～5×106/ml,培养条件为37℃,8％co2，130～150rpm悬浮培养，在转染前两代必须去除抗结团剂。
质粒的准备：转染用质粒为浓度1～5μg/μl,必须干净、无菌、无有机物溶剂及氯化钠等无机盐污染。
转染用细胞悬液的制备：转染前将细胞从培养箱中取出，使用细胞分流的方法获得单细胞悬液，取样计数，此时细胞活力需达到95％以上，用稀释法将细胞悬液调整为1×106/ml，放入培养箱中摇动培养直至转染。
optiprotmsfm-质粒dna混合液制备：在50ml离心管中加入1.45ml的optiprotmsfm，再加入50μg的质粒，总体积为1.5ml，轻柔混匀。
optiprotmsfm-freestlyetmmax混合液的制备：使用前先将freestlyetmmaxreagent轻轻地上下颠倒混匀。去50ml离心管，加入1.45mloptiprotmsfm，再加入50μlfreestlyetmmaxreagent轻柔混匀。
optiprotmsfm-freestlyetmmax混合液制备好后，立即用移液器将混合液缓慢加入optiprotmsfm-质粒dna混合，缓慢颠倒混匀，室温静置15min，使质粒dna-脂质体复合体形成。
将上述3ml的dna-freestlyetmmax混合液一滴一滴加入细胞摇瓶中，一边加一边晃动细胞摇瓶。
将转染后的细胞放回培养箱中继续培养48小时，培养条件为：37℃,8％co2，130～150rpm摇动培养。
2.2.4westernblot法鉴定β-ngf-fc融合蛋白的表达
样品的收集
将转染48小时后的细胞收集，1000rpm，离心5min，将上清液收集，置于冰上待用，剩余细胞加入细胞裂解液ripa2ml，并加入pmsf50μl，混匀，冰上放置30min，反复混匀4～5次，1000rpm，离心5min除去细胞碎片，小心吸取上清置于冰上备用。转染空白质粒的cho-s细胞作为阴性对照，处理方法同上。
还原sds-page
取细胞上清液及细胞裂解液各20μl于1.5ml离心管中，加入4×loadingbuffer5μl，reducingagent2μl，混匀。沸水加热2min，6000rpm，离心1min，4～12％bis-trisgel每孔上样25μl，200v稳压，电泳35min。
转膜
使用invitrogeniblot蛋白半干式电转仪进行转膜，从下至上依次放入配套的转膜底，电泳后凝胶，滤纸，转膜顶及海绵，按照转膜仪程序转膜7min，然后取出pvdf膜，在正面做好标记。
抗体的孵育
封闭：将pvdf膜放入封闭液(含有5％脱脂奶粉的tbst缓冲液)中封闭1h。
一抗：使用新鲜封闭液依次1:500稀释兔抗人神经生长因子单克隆抗体，小鼠抗人igg1fc单克隆抗体，鼠抗gapdh单克隆抗体，将前二者分别孵育细胞上清液样品，gapdh一抗孵育细胞裂解样品，4℃孵育过夜。
洗膜：配制含有0.11％吐温20的tbst洗液，10min/次，洗膜4次
二抗：使用新鲜封闭液依次1:10000稀释hrp标记的羊抗兔igg抗体，羊抗小鼠igg抗体，室温孵育1h。
10min/次，洗膜4次后准备显色反应。
显色反应
将显色剂peroxidebuffer与enhancersolution按1:1混合，均匀滴加到pvdf上，避光显色5min后，放入las-3000照相系统中照相。
2.2.5elisa法测定上清中ngf的含量
样品及试剂的准备：
样品：收集细胞悬液，1000rpm，离心10min，收集1ml细胞上清至1.5ml离心管中，13000rpm，离心10min，收集上清，按照10倍倍比稀释至浓度在2000pg/ml内。洗液：取20×浓缩洗液50ml倒入瓶中，加入去离子水950ml，混合均匀，置于4℃冰箱备用，保质期1个月。ngf标准品：用500μl稀释液复溶，100μl/支分装后于-20℃保存，有效期18个月，使用时用稀释液按1:500稀释，现用现配。
标准品的稀释与加样
在酶标包被板上设置标准品孔16孔，在第一、第二孔中分别加入标准品100μl，然后在第一、第二孔中加入标准品稀释液50μl，吹打混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加入到第三孔和第四孔中，再在第三孔、第四孔中加入标准品稀释液50μl，吹打混匀；以此类推，最后在混匀的十五孔、十六孔中各取50ul液体弃去。(稀释后个孔的加样量为50μl，标准品的浓度依次为1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml)。加样时设置对照孔(转染空载体的cho-s细胞上清)，待测样品孔。将样品加于酶标板孔的底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
孵育：加样后的酶标板用封板膜封板后置于37℃孵箱孵育1小时。
洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入洗涤液300μl，静止30秒后弃去，如此重复3次，拍干。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，37℃孵箱孵育1小时，洗板3次。
显色：每孔加入显色液a50μl，显色液b50ul，轻轻振荡混匀，37℃孵箱避光显色30分钟。
终止：每孔加入终止液50μl，终止反应。
测定：以blank孔调零，450nm波长测定各孔的od值。
2.2.6鸡胚背根神经节法测融合蛋白活性
2.2.6.1鼠尾胶原的制备.配制0.1％醋酸溶液，经过10磅10分钟高压蒸汽灭菌后备用；取250克体重大白鼠一只，从尾部切断鼠尾，置于75％酒精浸泡30分钟；将鼠尾切成1.5厘米左右的小段，剥去毛皮，抽出尾腱置于平皿中；剪碎尾腱，浸入150ml的醋酸溶液，置4℃冰箱，并不时振荡；48小时后，将溶解后的尾腱移入灭菌离心管中，以4℃，4000rpm，离心30分钟；吸取上清液每500μl分装置离心管中，-20℃冰冻保存。
2.2.6.2活性测定方法
取经过高压灭菌处理后的玻璃细胞培养瓶(每个样品需要5个细胞培养瓶)，将冻存的鼠尾胶原融化后，按照每个细胞瓶取50μl，用弯头玻璃棒均匀涂于玻璃瓶底面的下1/3处，去掉瓶盖，置于超净台中干燥48小时；往每个培养瓶中加入2ml的含有10％fbs的dmem培养基，盖上瓶盖，在超净台中浸泡过夜；实验时，将解剖神经节的器械浸于生理盐水中，在解剖镜下取8日龄鸡胚的背根神经节，把培养瓶中的培养基倒掉，将神经节接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，每瓶接种3个神经节，于37℃孵箱中培养2小时；用无血清dmem培养基将活性参考品稀释到3au/ml,将样品稀释到3ng/ml；样品和参考品用无血清dmem培养基做3倍倍比稀释，参考品和样品都做5个稀释度(应稀释至出现阴性结果)，加入2ml液体到培养瓶中，并设立阴性对照(无血清dmem培养基)；置于37℃，5％二氧化碳孵箱中培养24小后，在显微镜下观察结果，根据背根神经节突起生长的不同程度做分级记录(用#、++++、+++、++、++、-表示结果)。
2.2.7第一阶段压力筛选。
2.2.7.1mtx溶液的配制。精密称量mtx粉末10mg，加入100～150μl的1mnaoh，因为mtx在ph至较高的环境下容易失活，所以一观察到mtx粉末完全溶解，就迅速加入ph为7.0的pbs溶液22ml，振荡混匀。利用0.22μm滤膜过滤除菌，取1.5ml离心管若干，分装成每管100μl，-80℃冰箱保存，现用现化。
2.2.7.2筛选试剂mtx浓度的选择.
取对数生长期的cho-s细胞，800rpm，离心5min，收集细胞，使用37℃预热的含有10％抗结团剂，8mm谷氨酰胺的cdforti无血清培养基重悬细胞，细胞计数仪计数，将细胞密度调整为1×104个/ml，1ml/孔接种至24孔细胞培养板中，放入37℃,8％co2细胞培养箱中培养24h。24h后，观察细胞密度增长至约为3×105个/毫升，加入mtx溶液，使浓度依次为0nmol/l、20nmol/l、40nmol/l、60nmol/l、80nmol/l、100nmol/l、110nmol/l、120nmol/l。将细胞培养板放回37℃,8％co2细胞培养箱中继续培养。每隔两天观察细胞死亡情况，每3～4天更换新鲜培养基，保持mtx浓度不变，细胞的最小致死剂量为mtx的工作浓度。
筛选试剂puromycin浓度的选择.
取对数生长期的cho-s细胞，800rpm，离心5min，收集细胞，使用37℃预热的含有10％抗结团剂，8mm谷氨酰胺的cdforti无血清培养基重悬细胞，细胞计数仪计数，将细胞密度调整为1×104个/毫升，1ml/孔接种至24孔细胞培养板中，放入37℃,8％co2细胞培养箱中培养24h。24h后，观察细胞密度增长至约为3x105个/毫升，加入puromycin溶液，使浓度依次为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、1.1μg/ml、1.2μg/ml。将细胞培养板放回37℃,8％co2细胞培养箱中继续培养。每隔两天观察细胞死亡情况，每3～4天更换新鲜培养基，保持puromycin浓度不变，细胞的最小致死剂量为puromycin的工作浓度。
2.2.7.4mtx、puromycin加压筛选。
取转染后24h细胞，1000rpm,离心5min后收集细胞并计数，将细胞密度调整为5×105个/ml，30ml/瓶接种至t150细胞培养瓶中，加入mtx及puromycin，使其终浓度分别为100nmol/l、10μg/ml，将细胞放回37℃，8％co2，湿度在80％左右的培养箱中静止培养。每隔两天取少量细胞悬液，记录其细胞活力。在第一阶段压力筛选的第10天，细胞活力降至最低，随后细胞活力开始回升，在第一阶段压力筛选的第14天，细胞活力恢复至40％以上，将细胞收集，将细胞浓度调整为3×105个/毫升，接种至125ml细胞摇瓶中，维持mtx、puromycin的浓度不变，将细胞放回培养箱中，130～150rpm悬浮培养。每3～4天对细胞进行传代，每次传代的细胞接种密度为3×105个/ml，维持mtx、puromycin的浓度不变。在第一阶段压力筛选的第23天，细胞活力恢复至85％以上，活细胞数大于1×106个/ml，第一阶段筛选完成，每瓶细胞冻存5管，其余细胞进入第二阶段压力筛选。
2.2.8第二阶段压力筛选
将第一阶段筛选得到的混合克隆细胞株接种到两个125ml细胞培养瓶中，培养体积为30ml，接种密度为3×105个/ml。第一个摇瓶中加入mtx至50nnol/ml，puromycin至30μg/ml。第二个摇瓶中加入mtx至1000nnol/ml，puromycin至30ug/ml。将上述摇瓶放置于37℃，8％co2细胞培养箱中，130～150rpm摇动培养，每两天取样计数，每周离心换液，保持筛选压力不变，当细胞活力呈现恢复的迹象，开始下一步传代筛选。摇瓶中筛选的细胞每3～4天传代一次，每次传代的细胞接种密度为3×105个/ml，当活细胞数大于6×105个/ml时，采用稀释传代法，根据新加入的培养基的量加入适量mtx、puromycin以维持压力不变。在第二阶段压力筛选的第39天，细胞活力均大于90％，标志第二阶段压力筛选结束，每个细胞冻存5管，其余细胞开始进行表达量评价。
2.2.9单克隆筛选
2.2.9.1有限稀释法获得单克隆细胞
准备96孔细胞培养板、50ml离心管、1.5ml离心管若干，分别做好标记。收集所有细胞，1000rpm、离心5min，使用含有8mm谷氨酰胺、100nmol/lmtx、10μg/mlpuromycin，1％抗结团剂的cdforti无血清培养基10ml将细胞重悬，吹打混匀后计数。测得细胞密度为1.8×106个/ml，取细胞悬液1ml加入15ml离心管中，加入培养基800μl，吹打混匀，得到密度为1.0×106个/ml的细胞悬液。从上述细胞悬液中取1ml加入50ml离心管中，再加入9ml新鲜培养基，充分吹打混匀，得到密度为1.0×105个/ml的细胞悬液。重复上述步骤三次，得到密度为100个/ml的细胞悬液。取上述细胞悬液2ml至50ml离心管中，加入38ml新鲜培养基，拧紧瓶盖，充分颠倒混匀，即得到细胞密度为5个/ml，每200ul含有1个细胞。在96孔细胞培养板的四周边缘36个孔中，分别每孔加入空白培养基200μl/孔，中间60个孔中分别每孔加入细胞悬液200μl/孔，共得到25个96孔细胞培养板。细胞铺板完成后，随即在显微镜下逐一进行观察，将孔中有且仅有1个细胞的孔进行标记，即为单克隆孔。不含有细胞或者含有两个及两个以上的细胞的孔标记为废弃孔，后续不再进行观察，此时共得到527个单克隆细胞孔。将观察后的96孔细胞培养板放回孵箱中，37℃，8％co2静置培养20天。20天后取出96孔细胞培养板，对单克隆孔在显微镜下一一观察期生长情况，其中392株单克隆细胞株得以生长，我们挑选其中生长速度较快的240株单克隆细胞，将其接种至24孔细胞培养板中，每孔加入1.5ml的新鲜培养基，维持puromycin及mtx的浓度不变，将10个24孔细胞培养板放回细胞培养箱中，静置培养5天。5天后，将24孔细胞培养板中的细胞接种至6孔细胞培养板中，每孔添加2ml新鲜培养基，每3天对细胞进行传代，传代比例为1:3，进行3次细胞传代后，我们取少量细胞上清，用elisa的方法对融合蛋白的产量进行评估。根据elisa结果，选取其中融合蛋白表达量最高的10株细胞继续扩大培养至125ml细胞摇瓶中继续培养，并最终选定c6#株细胞株作为种子细胞进行扩大培养。
2.3结果
2.3.1westernblot结果
图2.1β-ngf及igg-fc的表达验证1.转染pcho1.0-β-ngf-fc质粒的48小时后细胞上清；2.转染β、-ngf△rra-fc质粒48小时后细胞上清；3.转染β-ngf△opt–fc质粒48小时后细胞上清；4.转染pcho1.0质粒48小时后细胞上清。取转染48小时后的细胞悬液计数，将细胞密度调节一致后，分别取1ml细胞悬液进行目的蛋白表达的验证。1000rpm离心5min，分别收集细胞及细胞上清，将细胞裂解后使用antigapdh抗体进行验证，细胞上清分别使用兔抗人β-ngf抗体及鼠抗人iggfc抗体进行表达验证。实验结果如图2.1，与转染空载体的cho-s相比，转染3种目的质粒后，均可明显看到ngf以及fc表达，而阴性对照中未见相关成分。
2.3.2elisa实验结果
图2.2ngf含量标准曲线.经wb实验证实，细胞上清中确实含有ngf及igg1fc成分，为进一步确定瞬时表达48小时细胞上清中含有的重组蛋白表达量，本研究使用elisa法进行了测定。因目前无法直接测定融合蛋白的含量，我们选用humanβngfelisakit测定细胞上清中ngf的含量，间接表现细胞上清中融合蛋白的含量。ngf含量标准曲线见图2.2，经测定细胞上清中ngf的含量分别为：β-ngf-fc：132ng/ml；
β-ngf△rra-fc：157ng/ml；β-ngf△opt–fc：223ng/ml。
2.3.3鸡胚背根神经节测得融合蛋白活性
图2.3鸡胚背根神经节测得融合蛋白活性standard1～5依次为：3au/ml标准品、1au/ml标准品、0.33au/ml标准品、0.11au/ml标准品、0.03au/ml标准品；空白对照为转染空载体后48小时细胞上清；β-ngf-fc1～5依次为：稀释45倍细胞上清、稀释135倍细胞上清、稀405释倍细胞上清、稀释1215倍细胞上清、稀释3645倍细胞上清；β-ngf△rra-fc依次为：稀释50倍细胞上清、稀释150倍细胞上清、稀释450倍细胞上清、稀释1350倍细胞上清、稀释4050倍细胞上清；β-ngf△opt–fc1～5依次为：稀释70倍细胞上清、稀释210倍细胞上清、稀释630倍细胞上清、稀释1890倍细胞上清、稀释5670倍细胞上清。阴性对照中未见到神经节生长，说明转染空载体的细胞上清中不含有神经生长因子，而转染了重组表达载体的细胞上清中，均可以看到明显的神经轴突生长，说明了转染了重组表达载体的cho-s细胞可以表达β-ngf，且表达蛋白具有生物学活性。通过与标准品对比，当样品浓度为1ng/ml时，样品中神经节轴突生长状况与标准品中1au/ml相当，判断样品的活性分别为：β-ngf-fc：135au/ml；β-ngf△rra-fc：150au/ml；β-ngf△opt–fc：210au/ml。
2.3.4第一阶段压力筛选
由图2.4可知，在加入mtx及puromycin后，细胞活力逐渐降低，在筛选开始后的第10天均达到最低值，约只有20％左右，随后细胞活力开始逐渐上升，在开始筛选后的第23天，细胞活力恢复至90％以上，标志着第一阶段压力筛选结束，细胞进入第二阶段压力筛选。
2.3.5蛋白产量评估
在第二阶段压力筛选的末期，我们对三株混合克隆细胞进行了生长状况及蛋白产率的评估，由图2.5细胞生长示意图。可知，三株细胞生长曲线基本一致，未见明显过快或过慢细胞株，而有图2.6蛋白产量示意图。可知，经密码子优化的细胞株其重组蛋白的产量明显高于其余两株细胞，在第九天我们测得的细胞上清中的β-ngf的可以达到15mg/l,而另外两株细胞的蛋白表达量只有6mg/l左右，可见经过了密码子优化后的β-ngf△opt–fc细胞株产量显著提高，故选择该细胞株进入下一步单克隆筛选阶段。
2.3.6单克隆筛选结果
在单克隆筛选阶段一共铺了25块96孔细胞培养板，经观察共得到单克隆细胞孔527个。经过50天的筛选，最终得到10株表达量较高的单克隆细胞株，分别编号为c#1～c#10。将这10株细胞扩大培养后再次进行了表达量的评估，评估结果见图2.7不同克隆表达量比较。将10株单克隆细胞进行冻存，并取细胞株c6#继续扩大培养用于后期纯化及研究。
2.4讨论
在第一部分中，通过全基因合成及重叠pcr的方法，分别获得了重组人β-ngf-fc、β-ngf△opt-fc以及β-ngf△rra-fc基因序列，经过双酶切后将目的基因连接入pcho1.0表达载体中，通过菌落pcr鉴定、酶切酶切鉴定及测序鉴定后，测序结果与目的基因序列完全一致，说明成功构建了目的表达载体。但构建的表达载体究竟能不能表达出想要的目的蛋白，表达量是多少，目的蛋白的结构是否正确以及究竟有没有生物学活性，这就需要进行下一步的实验。在表达系统的选择方面，本研究分别比较了大肠杆菌表达系统、昆虫及酵母表达系统以及哺乳动物表达系统这三种不同的表达系统。首先，大肠杆菌表达系统是最为常见的表达系统，它具有表达量高、表达速度快、生产成本低廉、抗污染的能力强等多种优点，也是很多重组类药物首选的表达系统。但是，大肠杆菌作为一种原核表达系统，不具有内质网、高尔基体等细胞器，对产生的重组蛋白不能进行进一步的修饰，而就神经生长因子来说，蛋白质的折叠，糖基化及二硫键的形成，对于神经生长因子在体内的生物学活性都是至关重要要的。所以，虽然大肠杆菌表达系统具有以上所述的种种优点，本研究还是放弃选择该系统作为我们融合蛋白的表达系统。再看昆虫及酵母表达系统，二者虽均为真核表达系统，但其糖基化的方式又与哺乳动物表达系统不尽相同，为了保证我们重组表达的神经生长因子融合蛋白在体内具有较好的生物学活性，本研究最终选择了哺乳动物表达系统。但是，哺乳动物表达系统的产量较低，生产速度较慢，生产成本较高等多种劣势，本研究也通过加压筛选及单克隆筛选两个过程，希望获得稳定且高表达神经生长因子融合蛋白的细胞株。本研究选用cho-s细胞株作为我们的表达细胞株，因为该细胞株具有多种优点，第一：cho-s是一种哺乳动物细胞，可以促进二硫键的形成，进行准确的翻译后加工，这包括了蛋白质的糖基化、羧基化等使的重组蛋白无论是在分子结构、理化性质还是生物学功能方面均最接近于天然的蛋白质分子；第二：cho-s细胞是一种成纤维细胞，它很少分泌自身的内源性蛋白，该细胞还具有外分泌功能，有利于后期产物的纯化；第三，cho-s细胞具有较高的重组基因扩增及表达的能力，有助于提高重组蛋白的表达量；最后，该细胞适应无血清培养，大大简化了下游的生产，也使得生产过程更加容易控制。在瞬时转染时，转染前的质粒及细胞准备对于提高转染效率来说十分重要。首先，在质粒提取的过程中，应该严格遵循无菌操作，所用的各种器皿及离心管、移液管、移液器头等耗材均应该无菌，在质粒提取过程中，要尽量避免有机溶剂和氯化钠等无机盐的污染，有机溶剂污染会导致细胞细胞死亡，无机盐污染会影响dna-脂质体复合体的形成从而影响转染效率。在细胞准备方面，尽量选择复苏后第三代的细胞作为转染用细胞，在转染前细胞不要离心，否则会降低转染效率，要采取稀释法制备细胞悬液，转染时的细胞活力需高于98％。因瞬时转染受细胞状态、转染条件等多种因素影响，其转染效率具有很强的不确定性且表达量较低，所以还需要进一步实验获得可稳定表达重组融合蛋白的细胞株。与瞬时转染不同的是，在稳定转染中，携带有目的基因的表达质粒通过随机整合的方式进入宿主细胞的基因组中，并且可以随着宿主细胞的传代进行复制。但是，这种整合是一种小概率的随机事件，故我们需要利用抗性基因对细胞进行筛选，来筛选出因整合了目的载体从而获得了抗性基因的阳性克隆。需要注意的是，质粒在整合进宿主细胞的基因组中有时会发生不完整整合，即抗性基因整合进入了基因组中而目的基因却发生了丢失，这样就会出现假阳性克隆，故还需要对筛选得到的目的克隆做进一步筛选。因为本研究的目的是获得表达量最高的单克隆细胞，故选择细胞上清中的神经生长因子的含量作为筛选的指标。在单克隆筛选的过程中，最关键的是第一步，即有限稀释铺板这一步，若稀释及铺板操作恰当，可大大增加单克隆孔数。还需注意的是在铺板时，一定要选择在细胞生长状况良好时进行，可以有效提高单克隆细胞的生长效率。
2.5小结
通过脂质体转染的方法瞬时转染cho-s细胞，使用westernblot的方法证明三株混合克隆细胞均成功表达了目的蛋白，且蛋白质的大小与预期相符；使用elisa的方法进一步证明了目的蛋白的成功表达，且对表达量做了初步的测定；鸡胚背根神经节法证明了表达的融合蛋白具有生物学活性，且活性较高。至此，我们可以初步判断本研究所构建的pcho1.0-β-ngf-fc、pcho1.0β-ngf△opt-fc以及pcho1.0β-ngf△rra-fc三个表达质粒均可以高效转染cho-s细胞，且可以表达分子量正确且具有良好生物学活性的三株混合克隆，经过两个阶段的压力筛选及单克隆筛选，最终得到一株可以高效表达β-ngf-fc融合蛋白的细胞株并命名为cho-ngf-fc细胞株。
融合蛋白的纯化、理化分析及其活性测
3.1试剂与耗材
3.1.1主要实验试剂
proteina亲和层析柱：hitraptmrproteinaff，购自gehealthcare；乙酸乙酯，货号052-09041；12％三乙胺溶液，货号200-20021；37％乙腈溶液，货号018-26041；1-氯丁烷，货号033-14371；pth-氨基酸洗脱液，货号168-27351；三氟乙酸，货号204-10771；25％三氟乙酸溶液，货号201-10781；5％异硫氰酸苯酸溶液，货号161-27341，聚偏二氟乙烯膜；均购自日本岛津公司；立春红染色液，购自enogene公司，货号e1wp306；piercebcaproteinassaykit：购自thermofisher；二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合柠檬酸三钠、柠檬酸、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、无水氯化钙、冰醋酸、氯化钾、磷酸二氢钾、无水甲醇均购自国药化学试剂公司；tris-base，购自sigmaaldrich公司；furin蛋白酶，购自newenglandbiolabs公司；1mhepesbhffer，购自lifetechnologies公司；无血清dmem培养基，购自gibco，货号12440；胎牛血清fbs，购自gibco，货号10099；电泳缓冲液：nupagemessdsrunningbuffer(20x)，购自invitrogen公司，货号：np0007
loadingbuffer：nupageldssamplebuffer(4x)，购自lifetechnologies公司，货号：np0009；样品还原剂：nupagesamplereducingagent(10x)，购自novex公司，货号：np0007
预制胶：nupage4～12％bis-trisgel,10well；nupage10％bis-trisgel,10well,购自invitrogen公司，货号np0322box；蛋白质marker：seeblueplus2prestainedstandard，购自invitrogen公司，货号：lc9259；isoelectricfocusingcalibrationkit，购gehealthcar公司，货号17-0471；4-chloro-1-naphthol，购自sigma公司；二硫苏糖醇(dtt)，购自sigma公司。
3.2实验方法
3.2.1细胞上清的收集
收集处于对数生长期的c6#细胞，离心计数后将其播种至3个1000ml的细胞培养瓶中，每瓶加入330mlcdforti培养基，将细胞放入细胞培养箱后，37℃，8％co2，130～150rpm连续培养5天后，收集所有细胞悬液。1000rpm离心10min，收集上清液，然后用低温高速离心机，15000rpm，4℃离心30min，离去细胞碎片，收集全部上清，调节ph值至7.0，4℃冷藏备用。
3.2.2蛋白a亲和层析
流动相的配制
平衡缓冲液a：精密称取二水合磷酸二氢钠1.37g，十二水合磷酸氢二钠4.37g，加去离子水至950ml，调节ph值至7.0后加水定容至1000ml。使用0.45μm过滤膜过滤，脱气15min后，4℃备用，保质期6个月。洗脱缓冲液b：精密称取二水合柠檬酸三钠2.06g，柠檬酸17.8g，加去离子水至950ml，调节ph值至3.0后用水定容至1000ml。使用0.45μm过滤膜过滤，脱气15min后，4℃备用，保质期6个月。中和缓冲液：1.0mtris-hcl，调节ph值至9.0。柱子清洗液：精密称取氢氧化钠2.0g，氯化钠58.5g，使用去离子水定容至1000ml，使用0.45μm过滤膜过滤，脱气15min后，4℃备用，保质期6个月。
首先使用10个柱体积的平衡缓冲液a平衡亲和柱，观察导电率及基线变化，待二者趋向稳定后，再使用平衡缓冲液a平衡5个柱体积后，准备上样。取出准备好的细胞上清，置于冰水浴中，使其保持低温，设置上样速度为每分钟3ml。上样完成后，再次使用平衡缓冲液a冲洗柱子，观察导电率及基线再次回到开始的状态时，开始洗脱蛋白。准备无菌的1.5ml离心管若干，每管加入中和缓冲液200μl，将离心管依次编号后备用。此时将流动相转换为洗脱缓冲液b，流速设定为每分钟3ml，开始洗脱后，密切观察紫外检测器280nm处吸收情况变化，待280nm出吸收值开始显著增高时，开始收集流出液，每个ep管收集0.5ml流出液，到280nm处紫外吸收度降低至基线后停止收集。待洗脱完毕后，使用10个柱体积的清洗液清洗柱子，最后用20％乙醇保存柱子。
3.2.3纯化样品的还原sds-page电泳
分别取纯化后样品，1号、5号、10号、15号、20号、25号、30号、35号、40号、43号样品进行还原sds-page电泳鉴定，电泳方法见如下：
考马斯亮蓝染色液的配制：称取考马斯亮蓝r2501g，无水甲醇400ml，无水乙醇500ml，加去离子水至1000ml。考马斯亮蓝脱色液的配制：取无水甲醇300ml，冰醋酸100ml，加去离子水至1000ml。上样前样品的制备：取供试品20μl,samplereducingagent2μl,ldssamplebuffer5μl共计27μl混匀，沸水浴3分钟后备用。电泳缓冲液的制备：取messdsrunningbuffer25ml，用去离子水定容至500ml备用。撕去预制胶封口条，小心拔出样品梳，将预制胶装入电泳槽中，在电泳槽的前后槽中注满上述电泳缓冲液，每孔加入20μl样品。接通电源，先以80v条件下开始电源，待样品进入分离胶后，将电压调高至200v，直至样品跑至距离胶底部约1cm处，停止电泳。
将电泳后的凝胶从槽中取出，除去塑料外壳，将凝胶放入考马斯亮蓝染液中染色1小时后，放入脱色液中脱色，每小时换一次新的脱色液，直至凝胶底色变为无色透明状，停止脱色，将凝胶放入照相系统中照相。电泳结果见图3.2，根据电泳结果，将43管纯化样品合并，使用10kd的超滤管1000rpm，4℃离心10min，加入400μl去离子水复溶后，再次离心，除去盐离子，使用5ml去离子水复溶后即得纯化样品。
3.2.4bca法测定纯化后样品的蛋白含量
标准曲线的制备：取试剂盒中的bsa标准蛋白质溶液用水分别配制浓度为2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、800μg/ml、600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml的标准溶液。样品的预稀释：取纯化后样品，用去离子水分别稀释5倍、10倍、20倍及40倍。工作液的配制：取bca试剂盒中试剂a溶液49ml，试剂b溶液1ml后混匀，避光备用。加样：精密量取上述样品溶液和标准品溶液各25μl，分别加入干净的96孔细胞培养板中，每个浓度都设置一个平行的复孔。每孔加入工作液200μl，盖上黑色盖板，轻轻振荡1min，使其充分混匀后，将96孔板放入37℃孵箱中，避光孵育半小时。半小时后取出96孔板，室温放置5min，使用酶标仪检测562nm处吸光值。绘制标准曲线，计算样品中的蛋白含量。
3.2.5纯化样品的westernblot鉴定
取纯化后样品一支，用去离子水稀释至1mg/ml，取20ul样品溶液，加入loadingbuffer5μl，samplereducingagent2μl混匀，煮沸2min后，取10μl上样，一抗为rabbitanti-humanngfantibody，实验步骤同2.2.4
3.2.6纯化样品的n末端氨基酸序列测定
还原sds-page电泳，方法同3.3.3.转膜：方法同2.2.4.将转膜后的pvdf膜放入立春红染液，当可看见明显条带时，即刻取出pvdf膜.将pvdf膜在超纯水水中漂洗2到3次，每次3分钟，直至膜背景颜色完全褪去。将目的蛋白条带剪下，放入ppsq-33a蛋白质测序仪，运行17个循环。
3.2.7纯化样品的furin酶切反应
反应条件：25℃金属浴，酶切6小时
3.2.8酶切后样品的westernblot鉴定
取20ul酶切后样品溶液，加入loadingbuffer5μl，samplereducingagent2μl混匀，煮沸2min后，取10μl上样，一抗为rabbitanti-humanngfantibody，实验步骤同2.2.4
3.2.9酶切后样品的二次纯化
取经过furin蛋白酶切后的样品，再次进行rproteina亲和层析，获得目的蛋白，经bca法测定共获得融合蛋白2.02mg。
3.2.10紫外光谱扫描
使用紫外分光光度计对融合蛋白进行245nm～345nm波长扫描，扫描结果见图
3.2.11还原sds-page测定分子量
将融合蛋白稀释至1μg/ml，取样体积10μl，加样品处理液至总体积为20μl，电泳方法见3.3.3
3.2.12sds-page纯度测定
将融合蛋白稀释至1mg/ml,取样体积10μl，加样品处理液至总体积为20μl，电泳方法见3.3.3
3.2.13n-末端氨基酸序列测定
实验方法同3.3.6
3.2.14等电聚焦电泳测融合蛋白等电点
样品处理：将融合蛋白稀释至1mg/ml，取5μl备用.预电泳约5分钟，使用样品梳沾取少量样品上样。电泳：在稳压下，100v开始聚焦。电泳15分钟后增加电压至200v，电泳15分钟后再增加电压至450v，当电流下降至1ma时停止电压。染色：将凝胶取出，固定液(三氯醋酸)中固定半小时，将凝胶转移至染色液(硝酸银溶液)中染色1小时，随后将染色后的凝胶放入脱色液中脱色直至凝胶背景清晰。
3.2.15鉴别实验(免疫印迹法)
样品处理：将融合蛋白稀释至1μg/μl，取10μl上样。取mngf作为阳性对照10μl上样。sds-page电泳及转膜：同westernblot。一抗孵育：将转膜后的pvdf膜放入平皿中，加入pbs缓冲液15ml，兔抗人β-ngf抗体30μl，最后加入马血清5滴，室温摇晃过夜。pbs缓冲液洗膜4次，每次2分钟。二抗孵育：洗膜后，向平皿中加入pbs缓冲液15ml，abc-6200kit中二抗5滴，马血清5滴，1小时室温摇晃孵育。pbs缓冲液洗膜4次，每次2分钟。向平皿中加入放大剂(试剂盒中a液、b液各5滴混匀，需提前1小时配制)，室温摇晃孵育1小时。pbs缓冲液洗膜4次，每次2分钟。显色：显色液配制：15ml无水甲醇+显色剂(4-chloro-1-naphthol,氯萘酚)少许+15μl双氧水混匀，将pvdf膜放入显色液中摇晃，出现明显条带时终止显色。
3.2.16质谱分子量测定。
供试品溶液的处理,取50μl供试品(1mg/ml)，加入2μl1mol/l的dtt溶液，50℃孵育1h，备用。超高效液相色谱参数设定,柱温为35℃；样品保存温度为10℃；上样量10μg；按如下梯度洗脱：
质谱仪参数设定,质谱条件：ms模式采集数据；毛细管电压：3000v；cone电压：40v；去溶剂气体温度：350℃；源温：120℃；去溶剂气体流速：800l/h，扫描范围(m/z)：500-3000。分子量测定,用配制好的质谱仪校正溶液在扫描范围内对仪器进行校正，连接液相色谱仪与质谱仪，按设定的程序进行分子量的测定。
3.2.17酶解后质谱鉴定。
将融合蛋白稀释至1mg/ml,取样体积10μl进行还原sds-page电泳，电泳方法见3.3.3。将电泳后凝胶放入考马斯亮蓝染液中染色1h，将染色后凝胶放入脱色液中直至背景颜色脱去。切下需要分析的胶块，放入干净的1.5ml离心管中，向离心管中加入1ml的去离子水，清洗10min，将水移除，重复上述步骤一次。向离心管中加入1ml的胶内消化脱色液，清洗10min，将脱色液移除，重复一次。胶内消化脱色液配置：50％乙腈，25mm碳酸氢铵，加入乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。加10mmdtt，让胶粒吸收完全，放入56度水浴锅内，孵育1个小时。孵育完毕后，移除多余dtt液体，加入55mmiam，暗室室温孵育,45分钟。孵育完毕后，移除多余iam液体，加入25mm碳酸氢铵，清洗10分钟，并重复清洗一次。移除碳酸氢铵，加入脱色液清洗10分钟，并重复一次。乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。1μg/μl的酶储液以25mm碳酸氢铵稀释15倍，加入脱水后的胶粒中，让胶粒充分吸收。然后加入25mm碳酸氢铵没过胶粒，放入37度水浴锅，消化过夜。取10μl样品上机，使用质谱仪检测，液相梯度及流动相：液相：prominencenano2d(shimazhu)
柱料：c18，5um，150a(eprogen)；流速：400nl/min；液相梯度：见图3.19液相梯度表及曲线图
质谱仪器：microtof-qii(brukerdaltonics)
数据采集软件：brukerdaltonicsmicrotofcontrol
ms/ms扫描范围：50-2200m/z
碰撞气体：氩气
毛细管电压：1500v
干燥气体温度：150℃
3.2.18鸡胚背根神经节测定融合蛋白活性。
将鼠神经生长因子活性参考品预稀释200倍，然后分别进行×1，×3，×9，×21，×81倍稀释后进行活性测定。将未经过furin蛋白酶酶切的融合蛋白预稀释100000倍，然后分别进行×1，×3，×9，×21，×81倍稀释后进行活性测定。将经过furin蛋白酶酶切的融合蛋白预稀释70000倍，然后分别进行×1，×3，×9，×21，×81倍稀释后进行活性测定。使用dmen培养基为阴性对照
3.2.19tf-1细胞/mts比色法测定ngf活性。
试剂的配制。
基础培养基：量取胎牛血清(fbs)50ml加入prmi1640培养液450ml中，4℃保存。完全培养基：在基础培养基中添加鼠神经生长因子mngf(苏肽生，舒泰神制药股份有限公司)至终浓度为每1ml含mngf12u。pbs缓冲液：称取磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，氯化钠8g，氯化钾0.2g加水溶解至1l，经高压灭菌，室温保存期限不超过12个月。
tf-1细胞的准备。
tf-1细胞株用完全培养基于37℃,5％二氧化碳细胞培养箱中培养，控制细胞浓度在1ml培养液含有1.0×105～5.0×105个细胞，传代后24小时用于ngf生物学活性测定。
实验方法
实验准备：将分析培养基，pbs缓冲液预热至37℃，mts避光溶解，置4℃冰箱备用。
tf-1细胞悬液制备：取足量对数生长期的tf-1细胞悬液移至50ml离心管中，1000rpm，离心5分钟，弃去上清液，收集tf-1细胞。加入15mlpbs缓冲液将细胞重悬后，再次1000rpm，离心5分钟。上述步骤重复2次，用基础培养基将细胞配制为每1ml含有5×104个细胞的细胞悬液，置37℃,5％二氧化碳细胞培养箱中备用。
标准品溶液的制备：取重组人神经生长因子标准品复溶后，用基础培养基预稀释至100u/ml。供试品溶液的制备：将重组人β-ngf-fc融合蛋白溶解后，用基础培养基预稀释至100u/ml(每步稀释不超过10倍)。制备样本梯度：在96孔细胞培养板中，自a行至h行依次进行3倍倍比稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，每个孔分别留下100μl溶液，弃去孔中多余溶液，备用。向上述96孔细胞培养板中加入100μl/孔细胞悬液，放入湿盒中，置于37℃,5％二氧化碳细胞培养箱中连续培养72小时。72小时后，向每孔中加入20μlmts溶液，放回细胞培养箱中继续培养3小时。结果测定：3小时后，将细胞培养板振荡2分钟，放入酶标仪，在波长490nm出测定吸光度，记录测定结果。
3.3结果。
3.3.1蛋白a亲和层析结果。
细胞上清经proteina亲和层析纯化目的蛋白，由图3.1可知，在洗脱阶段我们只收集到了一个洗脱峰，共获得纯化蛋白43个1.5ml离心管。挑选其中10个样品进行还原sds-page电泳，电泳结果见图3.2，经sps-page还原电泳发现在50kd及60kd附近共获得两个蛋白条带，人神经生长因子的分子量约为13kd，igg1fc段的分子量约为34kd，判断目的蛋白应该位于50kd左右，而60kd处蛋白存在于洗脱峰流出液的所有阶段，说明该蛋白可以与proteina具有高亲和性，该处蛋白应该也含有fc段。为进一步确定60kd处条带是什么，本研究利用wb及n-末端氨基酸测序对融合蛋白进行了鉴定。
3.3结果.
3.3.1蛋白a亲和层析结果
细胞上清经proteina亲和层析纯化目的蛋白，由图3.1可知，在洗脱阶段我们只收集到了一个洗脱峰，共获得纯化蛋白43个1.5ml离心管。挑选其中10个样品进行还原sds-page电泳，电泳结果见图3.2亲和纯化产物的还原sds-page电泳图,m为蛋白质marker，1～11号样品分别为1号、5号、10号、15号、20号、25号、30号、35号、40号、43号样品，经sps-page还原电泳发现在50kd及60kd附近共获得两个蛋白条带，人神经生长因子的分子量约为13kd，igg1fc段的分子量约为34kd，判断目的蛋白应该位于50kd左右，而60kd处蛋白存在于洗脱峰流出液的所有阶段，说明该蛋白可以与proteina具有高亲和性，该处蛋白应该也含有fc段。为进一步确定60kd处条带是什么，本研究利用wb及n-末端氨基酸测序对融合蛋白进行了鉴定。
3.3.2bca法测定纯化产物的含量。
bca法测定蛋白浓度标准曲线见图3.1，根据标准曲线测定纯化蛋白的浓度为4.69mg/ml，共获得融合蛋白23.45mg。
3.3.3融合蛋白的westernblot鉴定结果。
westernblot鉴别实验结果见图3.2，由图可知50kd及60kd附近处的蛋白均可以与抗ngf抗体结合，说明两处蛋白均含有ngf成分。图3.3纯化产物的westernblot鉴定。m:蛋白质marker；1～4：β-ngf-fc融合蛋白样品。
3.3.4融合蛋白的n-末端氨基酸序列测定结果
图3.4为50kd处蛋白条带的n末端测序结果，测得的氨基酸序列为：1.ser；2.ser；3.ser；4.his；5.pro；6.ile；7.phe；8.his；9.arg；10.gly；11.glu；12.phe；13.ser；14.val；15.cys；经比对与ngf前15个氨基酸序列完全一致，判断50kd处条带为β-ngf-fc融合蛋白。图3.5为60kd处蛋白条带n末端测序结果，测得的氨基酸序列为：1.glu；2.pro；3.his；4.ser；5.glu；6.ser；7.asn；8.val；9.pro；10.ala；11.gly；12.his；13.thr；14.ile；15.pro；经比对该处蛋白条带与prongf的前15个氨基酸序列完全一致，判断60kd处蛋白条带为prongf-fc融合蛋白。图3.560kd处蛋白条带n末端测序结果。
3.3.5furin蛋白酶酶切后westernblot鉴定结果
酶切后融合蛋白westernblot鉴别实验结果见图3.6furin蛋白酶酶切后westernblot鉴定结果m：蛋白质marker；1:酶切前融合蛋白样品；2：furin蛋白酶酶切后融合蛋白，由图可知经过furin酶切后，60kd处的ngf前体被切掉。
3.3.6融合蛋白紫外光谱扫描结果
对融合蛋白进行了245nm～345nm紫外光谱扫描，结果图见图3.7，由图可知重组人β-ngf-fc融合蛋白在280nm处有最大吸收峰。
3.3.7还原sds-page测定分子量结果.
样品的还原sds-page分子量测定结果见图3.7，其中1-11条带为marker条带，条带s为重组β-ngf-fc融合蛋白，由结果可知融合蛋白分子量约为47.65kd。
3.3.8sds-page测定融合蛋白纯度。
sds-page纯度测定结果见图3.8sds-page测定融合蛋白纯度，page胶经凝胶成像系统扫描共有三带，其中3号为目的条带，占所有条带的93.39％。即融合蛋白的纯度为93.39％。
3.3.11鉴别实验(免疫印迹法)结果。
免疫印迹法鉴别实验结果见图3.11，图中条带1、2为重组人β-ngf-fc融合蛋白，条带m为蛋白质预染marker，条带3为小鼠下颌腺提取ngf。融合蛋白可以与兔抗人β-ngf单克隆抗体特异性结合。
3.2.12质谱测定融合蛋白分子量结果
质谱法测定融合蛋白分子量结果见图3.12及3.13，其中图3.12为融合蛋白多电荷质谱图，图3.13为分子量测定结果。重组人β-ngf-fc融合蛋白的理论分子量为39472.96da，在fc段含有一个岩藻糖，其理论分子量为1444.53da，即融合蛋白的理论分子量为40917.49da，由结果可知质谱实测分子量为40917.20da，二者相差0.29da，相对误差为0.0007％。
3.3.13融合蛋白的质谱鉴定。
使用胰蛋白酶水解β-ngf-fc融合蛋白后做质谱鉴定，共得到22个肽段与理论肽段向匹配(表1)，总氨基酸覆盖率为77％。其中β-ngf部分共得到9个肽段与理论肽段相符，氨基酸覆盖率为78.3％。igg1fc部分共得到13个肽段与理论肽段相符，氨基酸覆盖率为76.7％。
表一：与理论序列相匹配的肽段及位置。
fixedmodifications：carbamidomethyl(c)
variablemodifications：gln->pyro-glu(n-termq)，oxidation(m)
cleavagebytrypsin：cutsc-termsideofkrunlessnextresidueisp
sequencecoverage：77％
matchedpeptidesshowninboldred
3.3.14鸡胚背根神经节法测定融合蛋白活性
表二：鸡胚背根神经节法活性测定结果
图3.15鸡胚背根神经节法测定融合蛋白活性。
经测定，经过furin蛋白酶酶切后的融合蛋白的比活为1.04×105au/mg,未经过酶切的融合蛋白的比活为6.54×104au/mg。
3.3.15tf-1细胞/mts比色法测定ngf活性。
图3.16为五次活性测定结果之一，以该次结果为例：图中共有3条曲线，其中灰色曲线为标准曲线，蓝色曲线为经过furin蛋白酶酶切后的融合蛋白，红色曲线为没有经过酶切的融合蛋白，由下图可知，无论是否经过酶切的融合蛋白均可刺激tf-1细胞的增殖，经过拟合可以获得典型的四参数方程，且r2均大于0.99。
根据计算公式：
测得酶切后融合蛋白的活性为3.6×105u/ml，未经过酶切的融合蛋白的活性为5.02×105u/ml。根据bca法测定的蛋白浓度:酶切后融合蛋白为2.02mg/ml；未经过酶切的融合蛋白为4.69mg/ml，根据比活性计算公式得到酶切后融合蛋白的比活为1.84×105u/mg，未经过酶切的融合蛋白的比活为1.07×105u/mg。可见经过furin蛋白酶酶切后的融合蛋白的比活显著提高，由此推断prongf前体经过furin蛋白酶酶切后暴露出自由的n端，此时的ngf才具备生物学活性。五次实验测得结果汇总见下表：
表三：tf-1细胞/mts比色法活性测定结果
3.4讨论
proteina亲和层析是最常用来纯化含有igg结构的蛋白的方法。在ph值为7.0的环境中，proteina可以与fc段的ch2，ch3机构域特异性结合，从而将目的蛋白与杂蛋白分离。proteina亲和层析操作简单，每1ml的proteina填料可以结合50mg的fc段蛋白，蛋白回收率较高，既适用于少量蛋白的纯化与研究，也适用于大规模生产制备。纯化后融合蛋白经bca法测定浓度为4.69mg/ml，共获得融合蛋白23.45mg。融合蛋白经还原sds-page电泳后发现分别在50kd及60kd处有两个蛋白条带。根据分子量推断，β-ngf-fc融合蛋白的分子量应该在48kd左右，所以推断50kd处的蛋白条带应该为目的条带，但60kd处的蛋白条带存在于洗脱峰的所以阶段，说明该蛋白应该不是与proteina非特异性结合的杂蛋白，而是也含有fc片段从而与proteina特异性结合。为了进一步确定这两个蛋白条带的成分，本研究使用兔抗人βngf抗体对融合蛋白进行了wb鉴定，结果显示50kd及60kd处蛋白均可与兔抗人βngf抗体特异性结合，证明60kd处蛋白也具有ngf成分。考虑到二者分离度较好，我们将目的蛋白电泳分离后，分别切下进行了n-末端氨基酸序列测定。经测定50kd处的蛋白的前15个氨基酸分别为：ssshpifhrgefsvc，与ngf的前15个氨基酸完全一致，证明该处蛋白确实为β-ngf-fc融合蛋白。而60kd处的蛋白的前15个氨基酸分别为：ephsesnvpaghtip，与prongf的前15个氨基酸完全一致，证明此处蛋白为没有经过酶切的ngf前体蛋白。在生物体内，完整的ngf外显子是由241个氨基酸组成，通常称之为preprongf，preprongf前体在内质网中前18个氨基酸的信号肽被切割下来，形成了prongf前体，prongf前体含有223个氨基酸，在内质网中以同源二聚体的形式存在，然后被转移至高尔基体中，在这里furin蛋白酶可以特异性识别prongf前体中的arg-ser-lys-arg位点进行切割，生成成熟的ngf后转运至胞外，同时也有少部分未经切割的prongf前体被分泌到胞外。本研究纯化得到了大量的未经切割的prongf前体蛋白，考虑是否有可能是在细胞培养过程中细胞凋亡裂解后释放大量胞内蛋白，从而使prongf前体进入细胞上清中，但本实验在细胞培养中严格控制了培养时间，在收集细胞上清时细胞活力高达98％，上述情况应不会发生。并且在瞬时转染后的wb实验中并未见到60kd处条带，考虑应为prongf含量较低，未能被检测发现。在后续两个阶段的mtx及嘌呤霉素加压筛选及单克隆筛选后，获得了表达量较高的细胞株，使内源性的furin蛋白酶相对不足，不能将prongf前体完全切割，使得大量prongf前体被释放到了胞外。因为prongf前体也含有fc片段，故也被proteina亲和层析纯化出来。于是本实验利用furin蛋白酶在体外对融合蛋白进行了酶切，经wb鉴定酶切后60kd处的prongf前体被切除，得到了单一的目的条带。
3.5小结
利用rproteina亲和层析纯化获得目的蛋白，经bca法测定共获得融合蛋白23.45mg，经还原sds-page电泳发现分别在50kd及60kd处有两个目的条带。利用wb及n-末端氨基酸测定法对两个蛋白条带进行测定，经鉴定两条目的条带均可与兔抗人β-ngf抗体结合，50kd处蛋白条带的前15个氨基酸序列为：ssshpifhrgefsvc，与ngf的前15个氨基酸完全一致。60kd处的蛋白的前15个氨基酸分别为：ephsesnvpaghtip，与prongf的前15个氨基酸完全一致，证明该处蛋白条带为ngf前体。利用furin蛋白酶在体外对融合蛋白进行酶切后，60kd处前体蛋白被切去，经二次纯化后获得了单一的目的蛋白。sds-page电泳测定融合蛋白的纯度为93.39％；还原sds-page电泳测定融合蛋白的分子量为47.65kd；紫外光谱扫描融合蛋白在280nm处有最大吸收峰；等电聚焦电泳测定融合蛋白的等电点为4.55～5.85；酶切后融合蛋白n末端氨基酸测序结果为ssshpifhrgefsvc，n端均一且与ngf前15个氨基端序列完全一致；鉴别实验(免疫印迹法)鉴定融合蛋白可以与兔抗人βngf单克隆抗体特异性结合；质谱法测定融合蛋白的分子量为40917.49da；融合蛋白经胰蛋白酶酶解后进行质谱鉴定共获得22个与理论肽段相符的蛋白质片段，氨基酸覆盖率为77％；鸡胚背根神经节法测定酶切后融合蛋白的比活为1.04×105au/mg,未经过酶切的融合蛋白的比活为6.54×104au/mg；tf-1细胞/mts比色法测得酶切后融合蛋白的比活为1.84×105u/mg，未经过酶切的融合蛋白的比活为1.07×105u/m。
重组细胞株检定。
4.1实验试剂与仪器
4.1.1实验试剂
无血清培养基cdforticho，购自lifetechnologies公司；抗结团剂，anti-clumpingagent，购自gibco公司；谷氨酰胺，glutamine，购自gibco公司；胎牛血清，fbs，购自gibco公司；mem培养基，购自lifetechnologies公司；0.25％胰酶-edta，购自gibco公司；二苯甲酰胺荧光染料，购自sigma公司；无水甲醇，冰醋酸，柠檬酸，磷酸氢二钠，甘油均购自国药化学试剂公司。
4.2实验方法
4.2.1cho-ngf-fc细胞形态
取cho-ngf-fc及cho-s细胞以5×105/ml密度接种于75cm2细胞培养瓶中，每瓶接种15ml。将细胞培养瓶置于37℃，8％co2，湿度80％的细胞培养箱中培养3天。三天后，细胞生长至70％～80％汇合时，照相记录细胞形态。
4.2.2cho-ngf-fc细胞病毒因子检测。
取状态良好的bhk-21细胞1.0×105/ml接种于25cm2细胞培养瓶，加入mem培养基+3％胎牛血清共7ml于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，使其充分贴壁生长。cho-ngf-fc连续培养三天后取细胞悬液，反复冻融细胞3次(-70℃冻1小时，37℃融30分钟)，1000rpm离心5分钟，取上清0.5ml加入到培养24小时的bhk-21细胞中，37℃、5％二氧化碳条件下培养7天，同时用mem培养液0.5ml做阴性对照。培养7天后，观察细胞状态，反复冻融细胞3次(-70℃冻1小时，37℃融30分钟)，1000rpm离心5分钟，收集上清。取状态良好的bhk-21细胞1.0×105/ml接种于25cm2细胞培养瓶，加入mem培养基+3％胎牛血清共7ml于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，使其充分贴壁生长。24小时后吸弃培养液3ml，加入第3步收集上清3ml。37℃、5％二氧化碳条件下培养7天。培养7天后，观察细胞状态。重复3、4步骤一次。培养过程中根据细胞状态补充mem培养液。培养7天后，观察细胞状态。
4.2.3不同代次cho-ngf-fc细胞株表达量测定。
分别取p5，p10，p15,p20,p25,p30,p35,p40及p45代重组细胞株复苏后传至第三代时连续培养五天后取细胞上清，利用elisa法测定融合蛋白表达量。
4.2.4cho-ngf-fc细胞支原体检测。
细胞培养物的制备。待测细胞使用无抗生素培养基传代三次后，连续培养三天以上不换液，取细胞悬液1000rpm离心5分钟，取细胞上清于4℃备用。指示细胞(vero细胞)的制品。取已证明无支原体污染的vero一支，复苏后于25cm2细胞培养瓶中，加入无抗生素的dmem培养基+5％胎牛血清共5ml，置于37℃，5％二氧化碳条件下培养，细胞长满时进行细胞传代，细胞至少传代一次后使用。实验前取vero细胞消化后离心计数，以1.0×105/ml密度传至25cm2细胞培养瓶中，37℃，5％二氧化碳条件培养过夜。待测样品接种，取制备好的vero细胞，加入细胞培养物2ml，以无抗生素的dmem为阴性对照，加入2ml与细胞培养瓶中，接种后将细胞放回细胞培养箱中培养，指示细胞至少传代一次，末次传代时将细胞接种至含有盖玻片的6孔板中培养5天。dna染色及检测，5天后吸出培养板中的液体与6孔板中，加入固定液(无水甲醇与冰醋酸按3:1混合，现用现配)5ml，室温放置5分钟，吸出全部固定液。再次加入新鲜固定液5ml，室温放置10分钟，吸出所有固定液，是盖玻片在空气中自然干燥。每孔加入二苯甲酰胺荧光染料工作也5ml，盖上盖子，室温放置半个小时。吸出孔中染色液，每孔加入5ml无菌注射用水洗涤3次，用滤纸吸出多余水分，盖玻片于空气中干燥。取洁净的载玻片并滴封片液(取0.1mol/l枸橼酸钠溶液22.2ml，0.2mol/l磷酸氢二钠溶液27.8ml，取甘油50ml混匀，调节ph值至5.5)1滴，将盖玻片正面向下盖在封片液上，制成封片，与荧光倒置显微镜下观察。
4.3结果
4.3.1cho-ngf-fc细胞的形态
由图4.1可知，cho-ngf-fc细胞形态呈圆形，悬浮生长。与cho-s细胞相比二者形态相似，无明显区别。
4.3.2不同代次单克隆细胞表达目的蛋白量的检测。
分别取不同代次的单克隆细胞复苏，传至第三代后连续培养5天取细胞上清进行ngf含量的检测。检测表达量见图4.2，p5～p45：不同代次cho-ngf-fc细胞株由图可知，细胞传至45代ngf表达量无明显差异，约为18mg/l。说明细胞传代至45带时仍可以稳定表达目的蛋白，没有发生衰减。
4.3.3cho-ngf-fc细胞病毒因子检测。
病毒敏感细胞感染病毒后，往往会发生明显的细胞病变。bhk-21细胞是分离自幼叙利亚地鼠肾的单细胞克隆细胞，为病毒敏感细胞。该细胞为成纤维细胞，在正常培养条件下贴壁生长，感染起易感病毒后皱缩变圆至破裂、脱落。且ngf对bhk-21细胞的生长无促进作用，故用来检测细胞株是否存在病毒的污染，由图4.3实验组bhk-21细胞图片(x100)，4.4对照组bhk-21细胞图片(x100)可见，培养21天后，实验组细胞正常生长，无病变，与对照组细胞生长状况相同。
4.3.4cho-ngf-fc支原体检测。
检定结果见图4.5～4.6，在阴性对照组中，仅可看到指示细胞的细胞核呈现出黄绿色荧光，在阳性对照中，荧光显微镜下可以观察到大小不等的、不规则的荧光着色颗粒。cho-ngf-fc细胞株在镜下观察可见细胞核呈黄绿色，胞外无不规则颗粒状或丝状荧光着色。证明该细胞株无支原体污染。
4.4讨论
本研究在完成了cho-ngf-fc细胞株的构建后，对该株单克隆细胞进行了初步的检定工作。结果表明构建的重组细胞株在形态上呈圆形，悬浮生长。与未做任何转染的cho-s细胞相比，二者形态相似，并无明显的形态学改变。对多次传代细胞进行了ngf表达量的检测，实验结果表明细胞传代至45代仍可以稳定表达重组人神经生长因子，且表达量没有发生衰减。使用bhk-21病毒敏感细胞检测cho-ngf-fc细胞株有无病毒因子感染，结果表明该重组细胞株无病毒因子感染，使用指示细胞法检测cho-ngf-fc细胞株有无支原体感染，结果表明该细胞株无支原体污染。但是，还有很多检测项目有待后续进行，比如提取细胞总rna后进行rt-pcr检测基因转录水平是否发生了变化，利用q-pcr检测细胞中重组基因的拷贝数是否发生变化等。
序列表
<110>中国食品药品检定研究院
<120>高效表达重组人β-ngf-fc融合蛋白的cho细胞株及其构建方法
<150>cn2016108157382
<151>2016-09-12
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>725
<212>dna
<213>pcho1.0-beta-ngf-fc
<400>1
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