阿帕替尼有效生物标志物VEGFR-2基因检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及vegfr-2基因检测试剂盒，具体涉及阿帕替尼有效生物标志物vegfr-2基因检测试剂盒，该试剂盒通过构建vegfr-2基因检测的新的试剂盒，提供对阿帕替尼有效生物标志物的检测手段和工具。

背景技术：

据资料显示，胃癌是我国癌症第二大死因，每年新增胃癌病例及死亡病例占全球的40％以上。胃癌被视为具有流行病学和组织病理学特征的单一的异质性疾病。临床实践中，胃癌的诊断主要依据病理活检进行确诊，临床早期诊断通常通过胃镜取活检样本的方法，并综合临床参数如肿瘤指标等。临床实践证实，胃癌的诊断早晚会对病人的预后生存产生明显差异；根据tmn分期，i期的五年生存率为90％或以上，而iv期的五年生存率小于20％，可见差异之巨大。

研究显示，肿瘤新血管生成是肿瘤发生、进展、治疗应答过程中关键事件。抗血管生成治疗一直是恶性肿瘤治疗的研究热点，而现有的针对vegfr的药物研发进展缓慢。例如，2014年年底上市的阿帕替尼是我国自主研发的全球首个被批准用于晚期胃癌的小分子抗血管生成靶向药物，然而，阿帕替尼并非对所有患者疗效均一，既有数据显示其在胃癌的客观缓解率不足20％，因此，本领域面临的首要问题，是寻找灵敏的药效生物标志物以协助甄选适当的获益人群，从而提升阿帕替尼的临床有效率。本申请的研究团队前期应用pdx模型库结合临床疗效分析发现阿帕替尼对携带vegfr-2q472h位点纯合变异的pdx模型肿瘤具有极佳的疗效，而对杂合变异及野生型pdx则无效(如图1所示)；其中的四例携带vegfr-2q472h基因变异的恶性肿瘤(3例晚期胃癌，1例原发灶未明的转移腺癌)患者应用阿帕替尼均取得极佳疗效(4例均为pr)，肿瘤得到明显控制(如图2所示)。

目前，基因及变异位点检测主要是基于直接测序法，基于杂交测序法及基于酶的方法，实践显示，上述方法均存在成本较高，检测程序欠精简等缺陷。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的阿帕替尼有效生物标志物vegfr-2基因检测试剂盒，本申请利用pcr扩增及探针特异性杂交的方法，构建一种新型检测试剂盒，为vegfr-2基因检测提供方便快捷低成本的检测手段及工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种新的vegfr-2基因检测试剂盒，具体涉及一种阿帕替尼有效生物标志物vegfr-2基因检测试剂盒，本申请利用pcr扩增及探针特异性杂交的方法，构建新型检测阿帕替尼有效生物标志物vegfr-2基因的试剂盒，能为vegfr-2基因检测提供方便快捷低成本的检测手段及工具。

为达上述目的，本发明提供从受试者采集的生物学样本中，设计多个pcr引物得到最佳pcr扩增产物，包被构建最佳特异性结合探针，提高检测试剂盒的灵敏度。

基于现有技术研究的，vegfr-2是抗血管生成靶向药—阿帕替尼的有效靶点的基础，

本发明提供了一种检测阿帕替尼有效生物标志物vegfr-2基因的试剂盒，所述的试剂盒包括vegfr-2基因的特异性核酸引物，以及包被构建的特异性结合探针。

本发明中，所述的vegfr-2基因包括vegfr-2野生型及q472h杂合、纯合变异型基因。

所述的试剂盒还可以包括pcr的缓冲液。

所述的试剂盒还可以包括标准试剂和说明书，等等。

本发明还提供一种新的人外周血dna样本中vegfr-2基因野生型及q472h杂合、纯合变异型检测的方法，该方法包括如下步骤：提取外周血基因组dna，用vegfr-2特异性引物经过pcr扩增后，将带生物素标记的扩增产物与固定在8联孔/多孔板或dna微阵列上的vegfr-2野生型和q427h杂合、纯合变异型检测探针进行特异杂交反应，并通过链霉亲和素辣根过氧化物酶促显色反应获得检测结果。

本发明进行了临床胃癌病案检测，结果显示，本发明的试剂盒及检测方法能够体外定性检测人外周血dna样本中vegfr-2野生型及q472h杂合、纯合变异型基因，其检测vegfr-2基因，简易方便且成本较同类产品低。

本发明利用pcr扩增及探针特异性杂交，并进一步利用类似elisa的elona(enzyme-linkedoligonucleotideassay)方法，构建vegfr-2基因检测的新型试剂盒，该试剂盒能够体外定性检测人外周血dna样本中vegfr-2野生型及q472h杂合、纯合变异型基因，其检测vegfr-2基因，结果显示，携带该变异者对阿帕替尼临床应答良好，且该检测试剂盒操作简易方便，成本较同类产品低，为阿帕替尼的有效生物标志物检测提供鉴别快捷低成本的检测手段和工具。

附图说明

图1阿帕替尼对vegfr-2q472h纯合变异型pdx模型具有显著抑制作用

图2检测病案1，37岁男性患者，胃癌iv期,阿帕替尼治疗后胃部占位明显缓解，肿瘤标志物ca19-9显著下降；检测病案2，30岁女性，原发灶未明确的转移腺癌，阿帕替尼治疗后病灶suv值明显下降。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1临床检测胃癌患者

(1)8联孔/多孔板式elona法：

样品dna的制备：提取外周血dna，并纯化，dna的浓度应在10-60ng/ul之间,a260/a280比值在1.5-2.0；

pcr扩增液准备：设计vegfr-2特异性扩增引物，并加入扩增液以及样品dna溶液，混匀；

pcr扩增：将各管放入pcr仪中，按下列条件扩增：50℃5min；94℃5min；94℃5sec，60℃25sec，72℃30sec，35cycles；72℃5min。取出扩增产物，4-8℃保存；

杂交反应：将vegfr-2野生型及杂合、纯合变异型的特异性探针包被于8联孔/多孔板上，具体步骤如下：在透明平底8联孔/多孔板的每个孔中，加入200ul乙醇/乙酸盐混合液。用包被缓冲液(ph＝9.0)稀释特异性探针(包括野生型、杂合变异型、纯合变异型)至终浓度为20nm，每孔加100μl，室温包被30min；每孔注满洗涤液静置5秒后倒掉洗液，再重复3次，最后一次吸水纸上拍干；每孔加入300μl封闭液，室温封闭1h；洗板；探针包被完成，在-20℃保存备用；

加入pcr扩增产物，室温包被30min，洗板；每孔加入300μl封闭液，室温封闭1h；洗板；结合缓冲液倍比稀释标准品dna，设置5个浓度点(参照浓度梯度稀释表)，室温孵育2h；洗板；结合缓冲液稀释检测二抗或streptavidin-hrp，室温孵育0.5-1h；洗板；每孔加显色液(显色液a液b液使用前室温平衡1：1配制)，37℃孵育20min，避光；每孔加100μl终止液，轻轻震荡，以保证充分反应；酶标仪读数：450nm。参比波长：650nm；

结果显示，该检测方法能够体外定性检测人外周血dna样本中vegfr-2野生型及q472h杂合、纯合变异型基因，其检测vegfr-2基因，结果显示，携带该变异者对阿帕替尼临床应答良好，且该检测试剂盒操作简易方便，成本较同类产品低。

实施例2临床检测胃癌患者

dna微阵列式elona法：

样品dna的制备：提取外周血dna，并纯化。dna的浓度应在10-60ng/ul之间,a260/a280比值在1.5-2.0；

pcr扩增液准备：设计vegfr-2特异性扩增引物，并加入扩增液、taq酶，ung酶以及样品dna溶液，混匀；

pcr扩增：将各管放入pcr仪中，按下列条件扩增：50℃5min；94℃5min；94℃5sec，60℃25sec，72℃30sec，35cycles；72℃5min。取出扩增产物，4-8℃保存；杂交显色：构建基因芯片，包括醛基基片，vegfr-2基因野生型及q472h变异型检测探针，质控探针，将基因芯片放入杂交仪片架中，将pcr扩增产物、杂交缓冲液、免疫显色液按照一定比例加入试剂架相应位置，运行杂交程序，反应结束后，取出芯片，将芯片放入生物芯片识读仪中，用基因芯片图像分析软件进行图像扫描和数据分析，输出检验结果；

结果显示，该检测方法能够体外定性检测人外周血dna样本中vegfr-2野生型及q472h杂合、纯合变异型基因，其检测vegfr-2基因，结果显示，携带该变异者对阿帕替尼临床应答良好，且该检测试剂盒操作简易方便，成本较同类产品低。