一种适用于提取杨树干种子mRNA提取液配方及其用法的制作方法

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种适用于提取杨树干种子mrna的提取液配方。

背景技术：

杨树属于被子植物门(angiosperms)双子叶植物纲(dicots)杨柳科(salicaceae)杨属(populus)，为落叶乔木。我国原产杨树近60种，除热带外几乎皆有分布，是主要绿化造林树种，并具有很大的工业用途和一定的药用价值。且由于杨树基因组已成功测序，基因背景清晰，已成为林木科研领域最重要的模式树种之一。

作为林木领域的模式树种，其种子发育过程同样受到人们的关注，但干的杨树种子中脂类、蛋白以及淀粉的大量存在对传统提取mrna的方法形成了巨大的挑战，并且在现有文献中并无解决该困难的报道。故对干的杨树种子中提取mrna的方法亟待解决。

技术实现要素：

本发明目的是在于提供提取杨树干种子中mrna的配方，通过此方法可以快速而高效的提取已储存多年的杨树干种子中的mrna，以供科研需要，在其他种子如拟南芥和烟草等物种中，该方法同样有效。

说明书附图

表1不同年份杨树干种子mrna提取总浓度变化。

表2不同年份杨树干种子mrna提取样本中的230，260，280和320nm波长吸光光度值。

图1不同年份杨树干种子mrna提取样本电泳图。

图2烟草和拟南芥干种子mrna电泳图。

具体实施方式：

1.干种子mrna提取液配方如下：a组分：100mla组分由以下部分组成：丙酮40ml，甘油10ml，0.5mnaac40ml，1mm乙二胺四乙酸二钠10ml，100mlb组分由以下部分组成：盐酸胍35ml，2.5mnacl20ml，0.5mm乙二胺四乙酸二钠5ml，苯酚10ml，2mmtris-cl(ph＝8)30ml。

2.其使用方法如下：将干的杨树种子放入研钵中，倒入液氮研磨至完全粉状样，将粉状物加入至1.5ml离心管中，加入a组分1ml,-20℃静止30min，之后用移液器小心地将上清液吸出，加入0.75mlb组分，55℃水浴加热15min，取出后加入0.5ml氯仿震荡15min。12000rpm离心5min。

3.将上清小心转移至另一离心管中，加入等体积氯仿进行震荡。

4.4℃13000rpm离心8min，取上清。重复一次上述步骤。

5.上清加入用1/10体积naac和二倍体积无水乙醇沉淀15min，13000rpm离心10min。75％酒精洗两次,溶于30ul的水(depc水)中。

6.检测提取结果。

实施效果：

⑴通过分光光度法对mrna含量进行检测。结果表明，不同年份杨树干种子mrna提取总浓度无显著差异，说明该方法对提取储存多年的杨树种子mrna的效率基本一致(表1)。

⑵通过分光光度法对mrna纯度进行检测。结果表明，不同年份杨树干种子mrna提取样本中的230，260，280和320nm波长吸光光度值无显著差异(表2)，电泳结果证明未发生rna降解现象(图1)，图中左起依次为当年样品、第三年样品和第五年样品。

⑶用此方法提取烟草和拟南芥干种子，结果证明该方法同样适用于上述2个物种(图2)，图中泳道左起依次为烟草种子、拟南芥种子。

表1不同年份杨树干种子mrna提取总浓度变化

表2不同年份杨树干种子mrna提取样本中的260/280，260/230和320nm波长吸光光度值

技术特征：

技术总结
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种适用于杨树干种子核酸提取的提取液配方及使用方法。其特征是由以下成分及其含量组成(A组分和B组分)：100ml A组分由以下部分组成：丙酮40ml，甘油10ml，0.5M NaAc 40ml，1mM乙二胺四乙酸二钠10ml；100ml B组分由以下部分组成：盐酸胍35ml，2.5M NaCl20ml，0.5mM乙二胺四乙酸二钠5ml，苯酚10ml，2mM Tris‑cl(PH＝8)30ml。本发明能够从多年储藏的杨树干种子中提取完整的mRNA，同时本发明对提取烟草及拟南芥等植物干种子mRNA的提取也有很好的效果。

技术研发人员：曲春浦;许志茹;杨成君;胡彦波;刘关君
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2017.09.14
技术公布日：2019.03.22