IRAK-M多克隆抗体及其制备方法与流程

文档序号:17188766发布日期:2019-03-22 21:45阅读:347来源:国知局
IRAK-M多克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及抗体技术领域,具体涉及一种irak-m多克隆抗体及其制备方法。



背景技术:

irak-m(又称irak-3)是irak家族新发现的分子,irak家族中一系列分子在传导tlrs(toll-likereceptors)和il-1rs(interleukin-1receptor)介导的信号中起重要作用,而irak-m是本家族中现发现的唯一的负调控因子,irak-m缺失的动物模型中表现为tlr信号增强,即irak-m可以抑制tlr信号传导。此外还发现在细菌感染或内毒素耐受的模型的免疫负调控作用中都有irak-m的参与。

现有的irak-m蛋白来源包含小鼠和人,根据ncbi数据库中记录,猪irak-m分子基因存在预测序列(accessionnumberxm_003126363),开放阅读框长度分别为2259bp;对应氨基酸长度为753;预测分子量83.37kd。序列比对发现猪irak-m蛋白与人或鼠irak-m蛋白同源性较低。现有抗体的免疫原为小鼠irak-m氨基酸516-544位或人irak-m氨基酸581-596位,目前尚没有以猪irak-m蛋白的片段为免疫原的irak-m抗体,因此目前尚无针对猪irak-m蛋白的抗体可用于研究或应用。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前缺乏可用于研究或应用的针对猪irak-m蛋白的抗体,提供了一种irak-m多克隆抗体。现有的免疫原为鼠或人的irak-m蛋白片段、与猪irak-m蛋白免疫反应较差的irak-m抗体观察不到抗原抗体反应或结合。与之相比,本发明irak-m多克隆抗体与猪irak-m分子反应性良好,在western杂交中不产生影响目的蛋白检测的非特异反应,能够用于蛋白免疫印迹与荧光检测试验中特异性地与猪irak-m产生良好的免疫反应。

本发明采用以下技术方案解决上述的技术问题:

本发明技术方案之一:一种irak-m抗原,所述抗原为蛋白质,其氨基酸序列如序列表seqidno:1所示。

本发明技术方案之二:一种编码氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质的核酸。

本发明中,所述核酸的碱基序列较佳地如序列表seqidno:2所示。

本发明技术方案之三:一种载体,其含有编码氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质的核酸。

本发明中,所述载体可以为本领域常规的载体,较佳地为表达载体。所述表达载体较佳地为原核表达载体或真核表达载体,更佳地为原核表达载体,最佳地为带有6个组氨酸标签的原核表达载体,如pet28a。所述核酸的碱基序列较佳地如序列表seqidno:2所示。

本发明技术方案之四:一种包含如前所述载体的转化体。

本发明中,所述转化体可以为本领域常规的转化体,只要其含有如前所述的载体即可,较佳地为细菌、酵母或细胞,更佳地为细菌,最佳地为大肠杆菌(eshcerichiacoli),如大肠杆菌bl21表达菌株。

本发明技术方案之五:一种irak-m多克隆抗体的制备方法,其包括以下步骤:以氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质为免疫原免疫动物,从所述动物中获得所述irak-m多克隆抗体。

本发明中,所述免疫原可以为通过本领域常规的方式获得,只要所述免疫原是氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白即可,较佳地可通过化学合成法或生物合成法获得。所述生物合成法可以为本领域常规的生物合成法,较佳地为在原核或真核体系中表达并纯化氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质,更佳地为在原核体系中表达并纯化氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质。所述纯化可以为本领域常规的蛋白质纯化的方法,较佳地为通过在所述氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质n端或c端添加标签序列后通过亲和层析纯化,更佳地为在所述氨基酸序列如序列表seqidno:1所示的蛋白质c端添加6his标签后通过镍柱亲和层析纯化。所述原核体系较佳地为大肠杆菌(eshcerichiacoli)表达体系,所述真核体系较佳地为酵母(saccharomycescerevisiae)表达体系。所述动物可以为本领域常规的动物,较佳地为哺乳动物,如小鼠(musmusculus)、大鼠(rattusnorvegicus)或家兔(oryctolaguscuniculus),更佳地为小鼠或大鼠,最佳地为小鼠。

本发明中,所述免疫动物的方法可以为本领域常规的免疫方法,较佳地为多次免疫,这里多次指两次或以上,更佳地为第一次免疫后间隔两周第二次免疫,然后每隔一周免疫一次,免疫五次。所述从所述动物中获得所述irak-m多克隆抗体可以为本领域常规的操作,较佳地为免疫后收集含有所述irak-m多克隆抗体的被免疫的动物的血清,更佳地为五次免疫后收集含有所述irak-m多克隆抗体的被免疫的动物的血清。

本发明中,所述制备方法较佳地还可以包括检测所述抗体。所述检测的方法可以为本领域常规的检测抗体的方法,较佳地为选自western杂交、免疫沉淀和免疫荧光中的一种或多种。

本发明技术方案之六:一种irak-m多克隆抗体,其是通过前述制备方法所制得的。

本发明技术方案之七:如前所述irak-m多克隆抗体在检测猪irak-m蛋白中的应用。

本发明中,所述检测猪irak-m蛋白可以为本领域常规的检测方法,如免疫印迹、免疫荧光检测和免疫沉淀等,较佳地为免疫印迹或免疫荧光检测,更佳地为将含有所述irak-m多克隆抗体的血清按体积比1∶1000稀释后进行免疫印迹或将含有所述irak-m多克隆抗体的血清按体积比1∶200稀释后进行免疫荧光检测。

在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于:本发明提供的抗原由irak-m分子c端289个氨基酸构成,此段序列亲水性较高,具有较好的抗原性且具有特异性;通过原核表达抗原产量高;当抗原蛋白携带6his标签时,易于纯化,分子抗原性单一,经过纯化后产物纯度高,保证了免疫血清有较高的抗体低度,对猪irak-m蛋白有比较特异的抗原性;本发明irak-m多克隆抗体与猪irak-m分子反应性良好,在western杂交中不产生影响目的蛋白检测的非特异反应,能够用于蛋白免疫印迹与荧光检测试验中特异性地与猪irak-m产生良好的免疫反应,可在-70℃中长期保存一年以上,在4℃环境下保存3-6个月。使用tbst溶液按照体积比1∶1000稀释可用于蛋白免疫印记,使用pbs溶液按照体积比1∶200稀释可用于间接免疫荧光检测。

附图说明

图1为实施例1的irak-m多克隆抗体与cho细胞内过表达的irak-m的western杂交结果图。

图2为实施例1的irak-m多克隆抗体与人、猴和猪的irakm蛋白反应的western杂交结果图。

图3为实施例1的irak-m多克隆抗体在猪细胞中的免疫荧光定位实验细胞成像图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。

以下实施例中所用到的细胞和试剂来源如下:

marc145细胞、hela细胞、a549细胞、3d4细胞和pk15细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;flag抗体购自sigma公司。

实施例1免疫原和irak-m多克隆抗体的制备

使用正向引物f:5’-cgaggatccctcgaacatcagagctctacc-3’与反向引物r:5’-gcgaagcttggcaacacttgctttcttccc-3’以含有猪irak-m开放阅读框的质粒载体作为模板通过pcr扩增irak-m基因片段,该基因片段的起止位点为irak-m基因的第1378-2256位,序列如序列表seqidno.2所示。将pcr扩增得到的片段用bamhi与hindiii进行双酶切,连入pet28a载体中构建得到pet-irak-m原核表达载体的质粒,预测表达的重组蛋白具有289个氨基酸,序列如seqidno.1所示,并带有6his标签。

表达纯化重组蛋白,即得免疫原,具体步骤如下:

1)将pet-irak-m原核表达质粒转化入大肠杆菌bl21感受态细胞,在lb液体培养基中50μg/ml卡那霉素下,37℃200rpm培养,菌液od值达到0.4-0.6时加入iptg至终浓度1mmol/l,16℃160rpm诱导表达重组irak-m蛋白16h;

2)8000rpm离心2min去上清,收集菌体,10倍镍柱体积的结合缓冲液(bindingbuffer)重悬菌体,超声破碎菌体,超声时工作5s;停止5s;功率4hz,总共10分钟。破碎产物1500rpm离心10min,收集上清继续以12000rpm离心30min沉淀包涵体;

3)使用含2mol/l尿素的结合缓冲液(bindingbuffer)洗包涵体沉淀物后12000rpm离心30min沉淀;用6m尿素结合缓冲液溶解包涵体沉淀物,4℃过夜。12000rpm离心30min收集上清,上清中包含溶解的重组蛋白;

4)重组蛋白用his-tagni柱进行纯化,具体为:用0.45μm滤器过滤含重组蛋白的上清,用histrap镍离子螯合层析柱纯化蛋白;

5)将纯化得到蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合乳化注射小鼠制备多克隆抗体,具体为:取混合乳化的抗原0.3ml在小鼠背部分三点皮下注射,两周以后再次纯化重组蛋白,与弗氏不完全佐剂按体积比1∶1混合乳化后按与第一次免疫相同的方法第二次免疫,之后每隔一周免疫一次,第五次免疫一周后采血,获得小鼠抗血清,即得所述irak-m多克隆抗体。

该irak-m多克隆抗体可在-70℃中长期保存一年以上,在4度环境下保存3-6个月。

实施例2实施例1制得的irak-m多克隆抗体通过western杂交检测cho细胞真核表达irak-m-3×flag融合蛋白

western检测步骤如下:

1)将表达n端融合3×flag标签的irak-m的过表达载体转染cho细胞,24小时后收取细胞沉淀于离心管中;

2)沉淀加入细胞裂解液nonidetp-40(np-40)buffer(1%sds,1%np-40,50mmtris(ph8.0),150mmnacl,4mmpefablocsc,2mg/mlleupeptin,2mg/mlaprotinin),变澄清后煮沸5min,4℃12000rpm离心10min后取上清,;

3)向上清加入1/4体积5×蛋白上样buffer(2%sds,10%glycerol,60mmtris(ph6.8),5%β-巯基乙醇与0.01%溴酚蓝),煮沸10min,10%sds-page胶120v电泳90min后240ma转印pvdf膜2h,pvdf模使用5%脱脂乳室温封闭2h;封闭好的膜用tbst溶液按照1∶1000稀释的实施例1制得的irak-m多克隆抗体或用tbst溶液按照1∶1000稀释的flag抗体,4℃孵育过夜,tbst洗涤3次,每次10min;辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后tbst洗涤3次,每次10min,显色。

结果如图1所示。结果显示,使用tbst溶液按照体积比例1∶1000稀释该实施例1制得的irak-m多克隆抗体可用于蛋白免疫印记,能够产生较好的信号,如图1左半部所示。同样的样品用flag标签抗体杂交显示,irak-m多克隆抗体的主带大小正确,为72kd,如图1右半部所示。

实施例3irak-m多克隆抗体同人源与猪源细胞内irak-m的免疫反应

本实施例中所使用的marc145细胞为猴胚胎肾上皮细胞,hela细胞为人宫颈癌细胞,a549细胞为人肺腺癌细胞,3d4细胞为永生化猪肺泡巨噬细胞。

细胞裂解、sdspage电泳与western操作同实施例2,其中所用到的一抗为实施例1所制得的irak-m多抗。

结果如图2所示,本发明irak-m多抗与猴细胞marc145和人细胞hela、a549裂解液中的irak-m均未发生反应,而与仅与猪细胞3d4裂解液中的irak-m特异性地发生反应。

实施例4用实施例1的抗体通过免疫荧光检测irak-m蛋白在细胞内的定位

免疫荧光检测步骤如下:

1)在放有细胞爬片的24孔板中铺单层pk15细胞过夜,转染表达irakm与3×flag融合蛋白的真核表达质粒,转染后培养24h;

2)细胞爬片置于丙酮甲醇1∶1混合液中固定,室温封闭爬片30min,封闭液是5%阴性二抗血清;

3)用1×pbs按1∶200稀释一抗irak-m多克隆抗体或flag抗体,37度孵育30min后pbs洗3次,每次5min;用1×pbs按1∶400稀释二抗,37度孵育30min,针对irak-m多克隆抗体的二抗偶联有荧光基团alexfluor488,针对flag抗体的二抗偶联有荧光基团alexfluor549,pbs洗3次,每次5min;dapi染细胞核5min,pbs洗3次,每次5min。置于荧光显微镜下观察拍照。

结果如图3所示,图3a蓝色信号表示细胞核,图3b红色信号表示抗flag抗体,图3c绿色信号表示抗irak-m抗体,图3d为图3a-c叠加图,图中绿色和红色信号可以完全重合,表现为黄色,表示本发明的抗体与猪irak-m有特异性反应,可用于间接免疫荧光定位检测。

应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>irak-m多克隆抗体及其制备方法

<130>p1511321c

<141>2017-09-14

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>289

<212>prt

<213>susscrofa

<400>1

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