一种检测恙虫病东方体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、其专用引物和探针及用途与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及恙虫病东方体的分子生物学，涉及一种检测恙虫病东方体的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（rpa技术）快速检测恙虫病东方体的方法、其专用引物和探针及其用途。
背景技术：
：恙虫病东方体（orientiatsutsugamushi，ot），原称为恙虫病立克次体，属变形菌纲α亚群立克次体目立克次体科立克次体属。为恙虫病的病原体，是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。恙虫病东方体可引发人类恙虫病，以鼠类为主要传染源，经恙螨幼虫叮咬而传给人。主要流行于我国的东南与西南地区，近年来恙虫病发病率上升，并有自然疫源地扩展的趋势。恙虫病临床上以突发高热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大、皮疹为特征，有的伴有肺炎、脑膜炎等多种并发症，严重者可致多脏器衰竭甚至死亡。由于该病与其他热性病临床症状相似，且对常规青霉素类等抗生素不敏感，加上目前医院普遍未建立针对该病的特异性检测方法，临床上极易造成误诊，导致延误治疗甚至死亡。目前，对恙虫病东方体的检测方法主要包括过非特异的giemsa染色法、特异的免疫荧光抗体染色法、酶联免疫法、荧光定量pcr法等。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的恙虫病东方体的检测方法有重要意义。近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国twistdxinc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（recombinasepolymeraseamplification，rpa）被誉为是可替代pcr的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶）对dna模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测恙虫病东方体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测恙虫病东方体的检测方法。因此本发明的第一个目的是提供用于检测恙虫病东方体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据恙虫病东方体的保守基因56kda外膜蛋白基因（genbank:km115577）设计的，该基因含有730个碱基的核苷酸片段，具有seqidno.1所示的核苷酸序列。优选地，所述引物的长度为30bp以上。优选地，所述引物包括正向引物otf299和反向引物otr583，共两条，分别位于56kda外膜蛋白基因（genbank:km115577）第299至328核苷酸位点之间和第554至583核苷酸位点之间，具有如seqidno.2和seqidno.3所示的寡核苷酸序列，其中反向引物5’端标记生物素（biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链dna将标记有生物素。用于恙虫病东方体的rpa专用引物，是根据恙虫病东方体56kda外膜蛋白基因（genbank:km115577）序列设计的，所述恙虫病东方体56kda外膜蛋白基因保守序列具有seqidno.1所示的核苷酸序列。seqidno.1：agagcagagctagggtttatgtaccttagaaatataagcgctgaggttgaagtaggtaaaggcaaggttgaagtaggtaaaggtaaggcagattctggaggtgagataaaggcagattctggaggtgggacagatgctcctattatacgtaagcggtttaaacttacacctcctcagcctactataatgcctataagtatagctgatcgtgaccttgcggttgatattcctaacatacctcaggcgcaagcgcaagctgcaaatcctcagcttgatcatgagcaacgtgctgcagctaggatcgcttggttaaagaattgtgctggtattgactatagggtaaaagatcctaataatcttaatgggcctatggttataaatccggtgttgttaaatattccacagggtaaccctaatcctgttggaaatccaccgcagcgagcaaatcagcctgcagattttgcgatacataaccatgagcaatggaggtatatggtaattggacttgctgcattatcaaatgctaataaacctatcgatcctcctgtcaaagtattaactgatgaaattactcagaggaaggatgaagtaaggccacatgccgatatagtcggtattgaagttcctaatactgctttgcctaatagtgcatctgtcgaacagatacagaataaaatgcaagaattaggcgaggtattagaagagctcagagatttttttgatgggtata。所述引物中的正向引物具有seqidno.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有seqidno.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（biotin）。seqidno.2：5’ggatcgcttggttaaagaattgtgctggta3’seqidno.3：5’ccttcctctgagtaatttcatcagttaata3’。用于检测恙虫病东方体的rpa探针，是根据恙虫病东方体56kda外膜蛋白基因（genbank:km115577）序列设计的，所述恙虫病东方体56kda外膜蛋白基因保守序列具有seqidno.1所示的核苷酸序列。该探针位于56kda外膜蛋白基因第397至442核苷酸位点，具有seqidno.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（thf）。seqidno.4：5’attccacagggtaaccctaatcctgttggaatccaccgcagcgag3’。所述探针由荧光素、5’端序列、四氢呋喃（thf）、3’端序列及3’端延伸阻断基团组成。所述的荧光素为羧基荧光素fam或fitc等其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。一种用于检测恙虫病东方体的rpa方法，包括使用引物seqidno.2、seqidno.3和探针seqidno.4。所述用于检测恙虫病东方体的rpa方法中用于50μl的rpa反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10μmol/l，反向引物的浓度为10μmol/l，所述的探针的浓度为5μmol/l，镁离子浓度为280μmol/l，模板加样量为1μl。将2.1μl正向引物、2.1μl反向引物、0.6μl探针、1μl样品、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnfo反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。检测时加样量为5μl，试纸条显色时间控制在3-5min。本发明的第二个目的是提供用于检测恙虫病东方体的探针。所述探针是根据恙虫病东方体的保守基因56kda外膜蛋白设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了恙虫病东方体56kda外膜蛋白基因的保守区，此区域含有730个碱基的核苷酸片段，具有seqidno.1所示的核苷酸序列。优选地，所述探针由荧光素（如羧基荧光素fam）、5’端序列、四氢呋喃（thf）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（如磷酸基团）几部分组成。优选地，所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。优选地，所述探针具有seqidno.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素fam或fitc，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（thf）。所述探针与扩增后的标记有生物素的dna退火，rpa系统中的nfo核酸内切酶将在thf部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得fam和biotin双标记的扩增产物。本发明的第三个目的是提供了用于恙虫病东方体快速检测的rpa检测方法，所述方法采用上述的rpa引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条(hybridetect2t，mileniabiotecgmbh,germany)进行可视化判断。本发明所述的用于检测恙虫病东方体的rpa方法，包括以下步骤：（1）以待测样品基因组dna为模板，在所述引物组和探针的标记下进行rpa反应；（2）结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。优选地，本发明所述的用于检测恙虫病东方体的rpa方法，具体步骤如下：（1）扩增试剂准备和加样：将10μmol/l正向引物2.1μl、10μmol/l反向引物2.1μl、5μmol/l探针0.6μl、1μl待测样品、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。（2）扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。（3）结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。本发明用于检测恙虫病东方体的rpa方法，其原理是采用rpa技术，对恙虫病东方体的特异性保守靶序列，即恙虫病东方体56kda外膜蛋白的保守序列进行检测，该序列可作为恙虫病东方体的标志基因之一。本发明用于检测恙虫病东方体的rpa方法，节约了恙虫病东方体的检测时间，检测可在37℃下20min内完成扩增，整个检测过程可在1小时内完成，与常规pcr和实时荧光定量pcr需要数小时相比极大地缩短了检测时间。本发明用于检测恙虫病东方体的rpa方法，降低了反应温度，rpa只需要恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于荧光定量pcr的60-95℃以及lamp的63℃。本发明用于检测恙虫病东方体的rpa方法，更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，且样品不需要进行复杂反应。本发明用于检测恙虫病东方体的rpa方法，灵敏性高，特异性强。可用于现场或床旁检测，具有广阔的应用前景。附图说明以下将结合附图对本发明作进一步说明：图1显示rpa检测体系最优引物组合筛选中不同引物组合的检测结果每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，上为1-12组、阳性对照样品，下为各组的阴性对照；图2为确定检测恙虫病东方体rpa检测方法的最佳反向引物和探针组合浓度。设定反向引物的浓度梯度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，探针的浓度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，将三种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成9组，组合编号见表3，每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，nc代表阴性对照；（a）1-3组及其各组的阴性对照；（b）4-6组及其各组的阴性对照；（c）7-9组及其各组的阴性对照；图3为确定检测恙虫病东方体rpa检测方法的最佳加样量。设定加样量为1μl、2μl、5μl，且分别为每一组样品设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，nc代表阴性对照；图4为确定检测恙虫病东方体rpa检测方法的最佳扩增时间。设定扩增时间为10min、15min、20min，且分别为每一组扩增时间的样品设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，nc代表阴性对照；图5为检测恙虫病东方体rpa方法的灵敏度，将合成的阳性质粒进行定量，并以十倍倍比稀释的方式稀释出浓度为104-100copies/μl的质粒dna作为模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件，试验结果如图所示，nc代表阴性对照；图6为检测恙虫病东方体rpa方法的的特异性，分别恙虫病东方体、用立氏立克次体、贝氏柯克斯体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组dna作为模板进行试验，试验结果如图所示。具体实施方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所用rpa引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所有序列测定工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1、恙虫病东方体引物和探针的设计及筛选（1）引物和探针的设计发明人通过文献检索，分析确定本发明使用恙虫病东方体的56kda外膜蛋白基因中的特异性序列为目标基因。从ncbi数据库中获得已知的模板基因序列，即seqidno.1所示的核苷酸序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司对上述序列进行合成，作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、反应体系的优化等过程中作为模板使用。根据rpa引物及探针设计原则，设计7条引物及1条探针，如表1所示。表1引物及探针（2）引物筛选人工合成含有恙虫病东方体的56kda外膜蛋白基因的seqidno.1所示的序列的阳性质粒，以此质粒为模板，将引物与探针进行全面组合成12组引物组合，组合编号如表2所示。12组引物组合分别进行在37℃条件下进行rpa扩增，以侧向层析核酸检测试纸条检测线显出情况为指标，筛选出在37℃条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续rpa检测的评价和应用。筛选用的50μl的rpa反应体系如下：将10μmol/l正向引物2.1μl、10μmol/l反向引物2.1μl、10μmol/l探针0.6μl、1×1010copies/μl模板1μl、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到rpa反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每一组引物探针组合均设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。发明者还设置了一组阳性对照，阳性对照由twistamp®rpanfo试剂盒内提供，同时还为阳性对照设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，再用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测。每个反应设置一个复孔。表2引物探针组合编号12组引物组合的胶体金检测结果见图1。图1为检测时间为5min时12组探针探针组合、阳性对照及其相对应的阴性对照的侧向层析核酸检测试纸条的检测线和质控线的显示情况。本发明确定的引物组合包括：正向引物otf299和反向引物otr583，共两条，分别具有如seqidno.2和seqidno.3所示的寡核苷酸序列。（3）探针的确定表1列出的otprobe探针为本发明优选，探针由荧光素（如羧基荧光素fam）、5’端序列、四氢呋喃（thf）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（如磷酸基团）几部分组成。探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。探针具有seqidno.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（thf）。所述探针与扩增后的标记有生物素的dna退火，rpa系统中的nfo核酸内切酶将在thf部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得fam和biotin双标记的扩增产物。实施例2：rpa反应体系、扩增和检测条件的优化在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测是仍存在假阳性的情况，因此需对rpa反应体系、扩增和检测条件进行优化（1）引物探针浓度设定反向引物的浓度梯度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，探针的浓度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，将三种浓度的反向引物分别与两种浓度的探针进行组合，组合成6组组合，每组组合均设置一组阴性对照。分别在37℃条件下进行rpa扩增，扩增完毕以侧向层析核酸检测试纸条检测线显出情况为指标。筛选出扩增效果最好，且不出现假阳性的组合。表3反向引物浓度和探针浓度组合编号通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析见图2，为使图片能清晰显示，分a、b、c幅，并考虑经济因素，本发明确定的反向引物的浓度为10μmol/l、探针的浓度为5μmol/l。（2）加样量调整反应体系：将10μmol/l正向引物2.1μl、10μmol/l反向引物2.1μl、5μmol/l探针0.6μl、1×104copies/μl模板1μl、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反正第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。扩增完毕用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测。检测时设定加样量为1μl、2μl、5μl，每一组均设置了一组阴性对照。通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析见图3，1μl、2μl、5μl的加样量均未出现假阳性的情况，但1μl和2μl的加样量样品检测线条带较浅，考虑到后续灵敏度试验，本发明确定的加样量为5μl。（3）扩增时间50μl的rpa反应体系如下：将10μmol/l正向引物2.1μl、10μmol/l反向引物2.1μl、5μmol/l探针0.6μl、1×104copies/μl模板1μl、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增10min，15min，20min，均在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。发明者为每一组分别设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，再用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测。通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析，10min和15min的扩增时间样品检测线条带较浅，考虑到后续灵敏度试验，本发明确定的扩增时间为20min。综上，通过rpa反应体系、扩增和检测条件进行优化，本发现确定在使用10μm浓度的正向引物、10μm浓度的反向引物和5μm浓度的探针扩增20min，加样量为5μl，试纸条显色时间控制在3-5min时，检测效果最好。实施例3：rpa检测的灵敏度评价将ot阳性质粒按10倍比稀释成104到1个/μl等一系列不同浓度，各取1μl分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的扩增和检测条件对上述不同拷贝数的模板进行rpa检测，观察rpa检测的灵敏度。结果见图5，从10个/μl拷贝数开始以上样品均呈阳性，说明本发明rpa检测方法的灵敏度达到10个拷贝/μl。实施例4：rpa检测的特异性评价特异性评价以立氏立克次体、贝氏柯克斯体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组dna为对照，以确定本发明rpa检测方法的特异性。分别以恙虫病东方体、立氏立克次体、贝氏柯克斯体、黑龙江立克次体斑点、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌基因组dna为模板，采用如下反应体系：10μmol/l正向引物2.1μl、10μmol/l反向引物2.1μl、5μmol/l探针0.6μl、1μl样品、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀。结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。结果见图6，立氏立克次体、贝氏柯克斯体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组dna样品检测线均未出现条带，呈阴性，只有恙虫病东方体样品检测线出现清晰条带，呈阳性，说明本发明rpa检测方法对恙虫病东方体有很强的特异性。序列表<110>李越希<120>一种检测恙虫病东方体的rpa方法、其专用引物和探针及其用途<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>730<212>dna<213>恙虫病东方体(orientiatsutsugamushi)<220><221>misc_feature<222>(1)..(730)<400>1agagcagagctagggtttatgtaccttagaaatataagcgctgaggttgaagtaggtaaa60ggcaaggttgaagtaggtaaaggtaaggcagattctggaggtgagataaaggcagattct120ggaggtgggacagatgctcctattatacgtaagcggtttaaacttacacctcctcagcct180actataatgcctataagtatagctgatcgtgaccttgcggttgatattcctaacatacct240caggcgcaagcgcaagctgcaaatcctcagcttgatcatgagcaacgtgctgcagctagg300atcgcttggttaaagaattgtgctggtattgactatagggtaaaagatcctaataatctt360aatgggcctatggttataaatccggtgttgttaaatattccacagggtaaccctaatcct420gttggaaatccaccgcagcgagcaaatcagcctgcagattttgcgatacataaccatgag480caatggaggtatatggtaattggacttgctgcattatcaaatgctaataaacctatcgat540cctcctgtcaaagtattaactgatgaaattactcagaggaaggatgaagtaaggccacat600gccgatatagtcggtattgaagttcctaatactgctttgcctaatagtgcatctgtcgaa660cagatacagaataaaatgcaagaattaggcgaggtattagaaga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