一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法。

背景技术：

产脲酶微生物催化尿素的生化过程是微生物诱导碳酸盐沉淀技术的核心，可利用该过程诱发或控制岩土体中一系列化学反应，从而改善岩土体工程性质，其属于生物学和土木工程的交叉研究应用领域。巴氏生孢八叠球菌（sporosarcinapasteurii），又称巴氏芽孢八叠球菌或巴氏芽孢杆菌，是该项技术最常用的微生物之一，但采用传统的通用培养方法如nh4-ye培养基等单一培养基培养，巴氏生孢八叠球菌株脲酶产量较低，采用电导率法得到的结果一般仅为8~15u/ml。

为了提高巴氏生孢八叠球菌的脲酶活性，李萌等采用亚硝基胍诱变atcc11859的巴氏芽孢八叠球菌；vachal等以mtcc1761的巴氏芽孢八叠球菌为出发菌株，采用uv射线诱变。诱变方法均可以提高巴氏芽孢八叠球菌生产脲酶的能力。但是，诱变方法操作复杂，随机性高，在碱性条件下，ntg诱变过程中会形成重氮甲烷，其受到撞击后会导致爆炸，该操作过程极度危险；且亚硝基胍是一种强烈的致癌物质，对操作人员极易造成伤害。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足之处，提供一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制a液体培养基和b液体培养基：

a液体培养基包括柠檬酸钠2-5g/l、蛋白胨2-5g/l、牛肉膏2-5g/l、尿素15-20g/l、氯化镍0.02-0.05g/l，ph值为7-9；

b液体培养基包括酵母提取物20-30g/l、氯化铵10-15g/l、氯化镍0.02-0.05g/l，ph值为7-9；

（2）向a液体培养基中加入琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在a培养基固体平板上划线，恒温培养12-16小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有a液体培养基的试管中，在有氧条件下培养12-16小时，恒温27℃-37℃；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照1%-5%的接种量接种于装有b液体培养基的锥形瓶中，在有氧条件下扩大培养15小时以上，恒温27℃-37℃，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

所述a液体培养基和b液体培养基均用氢氧化钠溶液调节ph值。

所述氢氧化钠溶液的浓度为0.003-0.005mol/l。

步骤（2）中加入的琼脂粉的质量占a液体培养基的质量的百分比为1-2%。

相对于现有技术，本发明采用的是a和b顺序的双培养基培养巴氏生孢八叠球菌，在单菌落培养和菌种复活阶段（步骤（2））采用a培养基，在菌种扩大培养阶段（步骤（3））采用b培养基。结果证明该方法下巴氏生孢八叠球菌脲酶活性有巨大提升，且其操作简单、结果稳定，重复率高。

附图说明

图1是脲酶活性对比图。

图2是不同培养基脲酶活性对比图。

具体实施方式

本发明使用的巴氏生孢八叠球菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.3687。

实施例1：

一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制a液体培养基和b液体培养基：

a液体培养基包括柠檬酸钠2-5g/l、蛋白胨2-5g/l、牛肉膏2-5g/l、尿素15-20g/l、氯化镍0.02-0.05g/l，ph值为7-9；

b液体培养基包括酵母提取物20-30g/l、氯化铵10-15g/l、氯化镍0.02-0.05g/l，ph值为7-9；

（2）向a液体培养基中加入琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在a培养基固体平板上划线，恒温培养12-16小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有a液体培养基的试管中，在有氧条件下培养12-16小时，恒温27℃-37℃；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照1%-5%的接种量接种于装有b液体培养基的锥形瓶中，在有氧条件下扩大培养15小时以上，恒温27℃-37℃，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

所述a液体培养基和b液体培养基均用氢氧化钠溶液调节ph值。

所述氢氧化钠溶液的浓度为0.003-0.005mol/l。

步骤（2）中加入的琼脂粉的质量占a液体培养基的质量的百分比为1-2%。

实施例2：

一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制a液体培养基和b液体培养基：

a液体培养基包括柠檬酸钠2g/l、蛋白胨2g/l、牛肉膏3g/l、尿素15g/l、氯化镍0.02g/l，ph值为8；

b液体培养基包括酵母提取物20g/l、氯化铵15g/l、氯化镍0.02g/l，ph值为8；

（2）向a液体培养基中加入1%琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在a培养基固体平板上划线，32℃恒温培养12小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有a液体培养基5ml的试管中，在振荡培养箱中振荡培养12小时，恒温32℃，转速为180r/min；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照5%的接种量接种于装有100mlb液体培养基的锥形瓶中，在振荡培养箱中扩大培养24小时，转速为180r/min，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

按照上述试验步骤培养巴氏生孢八叠球菌，采用相同条件共重复三次进行平行试验，每两小时采用电导率法测定脲酶活性，培养时间设定为24小时。24小时后三次平行试验的脲酶活性分别为35.5u/ml、33.7u/ml和31.8u/ml，即最终平均脲酶活性为33.7u/ml。

针对上述实施例，共3次试验，采用ab双培养基的巴氏生孢八叠球菌（出发菌株来源中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.3687）的平均脲酶活性随培养时间变化曲线如图1所示，图中包含了亚硝基胍诱变后的巴氏生孢八叠球菌株和采用nh4-ye培养基的巴氏生孢八叠球菌株的脲酶活性平均值。由图1可以看出，培养结束时，采用ab双培养基的巴氏芽孢八叠球菌脲酶活性与经过亚硝基胍诱变的巴氏芽孢八叠球菌脲酶活性相当，可稳定在30u/ml以上；且明显高于采用nh4-ye培养基获得的巴氏芽孢八叠球菌脲酶活性，增长了146%。

其中亚硝基胍诱变后巴氏生孢八叠球菌株和采用nh4-ye培养基巴氏生孢八叠球菌株数据来源于李萌,程晓辉,杨钻,等.巴氏芽孢八叠球菌诱变选育脲酶高产菌株[j].中国农业科技导报，2013(6):130-134。

实施例3：

一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制a液体培养基和b液体培养基：

a液体培养基包括柠檬酸钠5g/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏5g/l、尿素20g/l、氯化镍0.05g/l，ph值为8；b液体培养基包括酵母提取物30g/l、氯化铵15g/l、氯化镍0.05g/l，ph值为8；

（2）向a液体培养基中加入1%琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在a培养基固体平板上划线，37℃恒温培养15小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有a液体培养基5ml的试管中，在振荡培养箱中振荡培养15小时，恒温37℃，转速为180r/min；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照3%的接种量接种于装有100mlb液体培养基的锥形瓶中，在振荡培养箱中扩大培养24小时，转速为180r/min，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

按照上述试验步骤培养巴氏生孢八叠球菌，采用相同条件共重复三次进行平行试验，培养时间设定为24小时。采用电导率法测试脲酶活性，24小时后三次平行试验的脲酶活性分别为31.7u/ml、30.7u/ml和33.9u/ml，即最终平均脲酶活性为32.1u/ml。

实施例4：

将巴氏生孢八叠球菌在单一a培养基（步骤2和3均采用a培养基）、单一b培养基（步骤2和3均采用b培养基）、单一ab混合培养基（步骤2和3均采用a和b的混合培养基，a和b的体积比为1:1）、ab双培养基（步骤2采用a培养基，步骤3采用b培养基）、ba双培养基（步骤2采用b培养基，步骤3采用a培养基）进行培养，培养条件与实施例1相同，仅改变培养基成分。扩大培养过程中采用电导率法平均每2小时测试一次脲酶活性，培养时间设定为24小时，共重复三次进行平行试验。

试验结束时，三次平行试验单一a培养基的脲酶活性值分别为8.3u/ml、8.5u/ml和8.1u/ml，平均脲酶活性为8.3u/ml；单一b培养基的脲酶活性值为14.3u/ml、12.5u/ml和13.8u/ml，平均脲酶活性为13.5u/ml；单一ab混合培养基的脲酶活性值为9.3u/ml、10.1u/ml和11.1u/ml，平均脲酶活性为10.2u/ml；ba双培养基的脲酶活性值为9.8u/ml、11.1u/ml和10.1u/ml，平均脲酶活性为10.3u/ml。不同培养基的巴氏生孢八叠球菌脲酶活性平均值与培养时间对比图如图2所示。由图2可以看出，ab双培养基获得的脲酶活性明显高于其它培养基，a和b培养基的顺序不可更换。

从上述实施例可以推测出，本发明配制的ab培养基，在步骤2的菌体生长初期，采用了营养组分较为贫瘠的a培养基，a培养基中的碳和氮等营养物质含量较少，但尿素含量高，菌体为适应该环境，激发了其产脲酶能力，对尿素分解产生营养物质，为其生长提供足够的营养物质。在步骤2结束时菌体有着较高的产脲酶能力。进一步在步骤3中，将菌体接种于营养组分较为丰富的b培养基，在丰富营养物质保障下，细胞大量繁殖，个体数量增加，保证了菌液整体的高脲酶活性。单一a培养基不能提供充足的营养物质保证菌群扩大，单一b、ba顺序和ab混合培养基无法激发菌体产脲酶能力，效果均劣于本发明提供的方法。

实施例5：

一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制a液体培养基和b液体培养基：

a液体培养基包括柠檬酸钠2g/l、蛋白胨2g/l、牛肉膏2g/l、尿素20g/l、氯化镍0.05g/l，ph值为7；b液体培养基包括酵母提取物20g/l、氯化铵10g/l、氯化镍0.02g/l，ph值为7；

（2）向a液体培养基中加入1%琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在a培养基固体平板上划线，27℃恒温培养12小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有a液体培养基5ml的试管中，在振荡培养箱中振荡培养12小时，恒温27℃，转速为150r/min；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照1%的接种量接种于装有100mlb液体培养基的锥形瓶中，在振荡培养箱中扩大培养18小时，转速为150r/min，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

按照上述试验步骤培养巴氏生孢八叠球菌，采用相同条件共重复三次进行平行试验，培养时间设定为18小时。采用电导率法测试脲酶活性，18小时后三次平行试验的脲酶活性分别为30.6u/ml、31.3u/ml和32.9u/ml，即最终平均脲酶活性为31.6u/ml。

实施例6：

一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，具体步骤如下：

（1）配制a液体培养基和b液体培养基：

a液体培养基包括柠檬酸钠5g/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏5g/l、尿素20g/l、氯化镍0.05g/l，ph值为9；b液体培养基包括酵母提取物30g/l、氯化铵15g/l、氯化镍0.05g/l，ph值为9；

（2）向a液体培养基中加入1%琼脂粉混合均匀后，倒平板直至凝固为固体状态，用巴氏生孢八叠球菌母液在a培养基固体平板上划线，37℃恒温培养16小时；然后从划线固体平板上挑单菌落，放置于装有a液体培养基10ml的试管中，在振荡培养箱中振荡培养16小时，恒温37℃，转速为200r/min；

（3）取步骤（2）振荡培养后的菌液，按照5%的接种量接种于装有100mlb液体培养基的锥形瓶中，在振荡培养箱中扩大培养30小时，转速为200r/min，即可获得高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌液。

按照上述试验步骤培养巴氏生孢八叠球菌，采用相同条件共重复三次进行平行试验，培养时间设定为30小时。采用电导率法测试脲酶活性，30小时后三次平行试验的脲酶活性分别为32.5u/ml、31.0u/ml和30.7u/ml，即最终平均脲酶活性为31.4u/ml。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。