干扰Hsa‑miR‑449a表达的试剂及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及干扰hsa-mir-449a表达的试剂及其应用，尤其涉及在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用。

背景技术：

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制尚未明确，目前对于肝癌的治疗并不理想，术后的复发和转移仍是亟待解决的一大难题。近年来的研究使肿瘤干细胞(cancerstemcells，cscs)的概念深入人心，越来越多的证据表明肿瘤干细胞与肿瘤的生长、耐药、复发和转移等密切相关。迄今为止，已在血液系统肿瘤及脑胶质瘤、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等30余种常见肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在。但是关于肿瘤干细胞内部的调控机制目前并不清楚，是否可以利用针对肿瘤干细胞调控分子的抑制剂来辅助肿瘤治疗也未有明确报道。

微小rna(microrna,mirna)是一种长度约为22～28个核苷酸的非编码rna，它们通过mrna介导的特异性的基因沉默导致靶mrna降解及抑制蛋白质的合成，调控转录后基因表达水平，影响细胞增殖、分化和凋亡。近年来，mirna介导的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,ptgs)与肿瘤形成的相关性已成为关注的热点。肿瘤细胞与正常组织细胞mirna表达谱有显著差异，mirna在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色。

hsa-mir-449a是肿瘤研究中新近兴起的一种mirna，在前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤中存在异常表达，可能与肿瘤的发生和发展过程密切相关，研究其功能及调控机制，可为肿瘤诊断、治疗和预后判断提供重要线索。

shrna又称“短发夹rna”，克隆到shrna表达载体中，在细胞内该发夹序列被表达出来，形成一个“双链rna”(shrna)，并被rnai通道处理，诱导实现靶mrna的降解。

技术实现要素：

综合现有技术的分析，hsa-mir-449a目前认为其为抑癌基因可以阻断肿瘤的发生发展，但是发明人在研究过程中意外发现hsa-mir-449a在肝癌干细胞中高表达提示其可能在肝癌干细胞中作为癌基因，促进肝癌的发生发展，而目前并没有学者研究hsa-mir-449a在干细胞中的作用，更没有关于hsa-mir-449a是癌基因的报道，发明人的研究打破了传统的关于hsa-mir-449a的学术理论，进一步，发明人提供了hsa-mir-449a新的功能和用途，以及一种干扰hsa-mir-449a表达的试剂及该试剂在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用。

有鉴于此，本发明的目的首先在于提出hsa-mir-449a新的功能及应用。其次，本发明的目的在于提供一种干扰hsa-mir-449a表达的试剂及应用，为肝癌的基因治疗提供新靶点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

促进肝癌干细胞自我更新的癌基因hsa-mir-449a，核苷酸序列如seqidno:1所示。

hsa-mir-449a目前认为其为抑癌基因可以阻断肿瘤的发生发展，但是发明人在研究过程中意外发现hsa-mir-449a在肝癌干细胞中表达可以作为癌基因，促进肝癌的发生发展。

进一步，本发明提供了hsa-mir-449a的新用途。hsa-mir-449a基因在抑制肝癌干细胞自我更新中的应用，是通过干扰hsa-mir-449a在肝癌干细胞中的表达来抑制肝癌干细胞自我更新。目前并没有学者研究hsa-mir-449a在干细胞中的作用，更没有关于hsa-mir-449a是癌基因的报道，发明人的研究打破了传统的关于hsa-mir-449a的学术理论，提供了hsa-mir-449a新的功能和用途。

抑制肝癌干细胞自我更新的药物，所述药物能干扰hsa-mir-449a在肝癌干细胞中的表达。

进一步，所述的药物为包含干扰hsa-mir-449a基因表达的核酸序列。

进一步，所述干扰hsa-mir-449a基因表达的核酸序列为利用seqidno:1所示序列设计的shrna。

进一步，所述shrna为sh-mir449a，所述sh-mir449a的核苷酸序列如seqidno：2所示。

发明人进一步提供了干扰hsa-mir-449a表达的试剂及其应用。

干扰hsa-mir-449a在肝癌干细胞中表达的试剂。

进一步，所述试剂为质粒plv-sh-mir449a。

优选的，所述试剂为含有质粒plv-sh-mir449a的表达载体。

优选的，所述试剂为含有质粒plv-sh-mir449a的转基因细胞系。

优选的，所述试剂为含有质粒plv-sh-mir449a的宿主菌。

优选的，所述试剂为含有质粒plv-sh-mir449a的慢病毒。

进一步，所述慢病毒由plv-sh-mir449a质粒转染细胞后，经包装、纯化所得。

优选的，所述慢病毒由plv-sh-mir449a质粒转染hek293t细胞后，经包装、纯化所得。

本发明所述的干扰hsa-mir-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中应用。

进一步，干扰hsa-mir-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞增殖的药物中的应用。

进一步，干扰hsa-mir-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞克隆形成的药物中的应用。

进一步，干扰hsa-mir-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞成球的药物中的应用。

进一步，干扰hsa-mir-449a表达的试剂在制备抑制肝癌干细胞皮下移植瘤形成的药物中的应用。

本发明最后还提供了一种干扰hsa-mir-449a在肝癌干细胞中表达的方法，包括如下进行的步骤：

(1)将慢病毒表达质粒plv-sh-449a转染宿主细胞，经包装、纯化得到含有质粒plv-sh-mir449a的慢病毒；

(2)取步骤(1)得到的慢病毒接种感染肝癌干细胞。

本发明的有益效果在于：

1)本发明首次公开了hsa-mir-449a在肝癌干细胞中表达并且对于维持肝癌干细胞自我更新至关重要。

2)本发明提供了hsa-mir-449a基因的新用途，hsa-mir-449a基因在抑制肝癌干细胞自我更新中的应用，是通过干扰hsa-mir-449a在肝癌干细胞中的表达来抑制肝癌干细胞自我更新。

3)本发明提供了干扰hsa-mir-449a表达的试剂，干扰hsa-mir-449a的表达试剂可以制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物，用于靶向治疗肝癌，对延长肝癌生存时间具有重要意义。

4)本发明提供了一种干扰hsa-mir-449a表达的方法，该方法能够干扰hsa-mir-449a的表达，进而抑制肝癌干细胞自我更新，即抑制肝癌干细胞的增殖、克隆形成、成球能力以及皮下移植瘤形成率，延缓体内肿瘤生长。

附图说明

图1为qrt-pcr检测hsa-mir-449a分别在成球培养的肝癌细胞(a)、nanog^pos的肝癌干细胞和nanog^neg的非肝癌干细胞(b)及耐药的肝癌细胞(c)中的表达。

图2为plv-sh-mir-449a图谱。

图3为nanog^pos的肝癌干细胞中干扰hsa-mir-449a的表达后，通过qrt-pcr检测hsa-mir-449a的干扰效率。

图4为干扰hsa-mir-449a的表达后检测克隆形成能力。

图5为干扰hsa-mir-449a的表达后检测成球能力。

图6为干扰hsa-mir-449a的表达后免疫缺陷小鼠nod/scid小鼠皮下移植瘤的图片(a)和重量(b)，接种细胞数为1×10²个细胞。

图7为免疫组化检测nanog和ki-67在移植瘤的表达水平。

图8为不同细胞数在nod/scid小鼠皮下移植瘤成瘤能力及干细胞形成比例。

图9为nanog^neg的肝癌细胞中过表达hsa-mir-449a后，通过qrt-pcr检测hsa-mir-449a的表达情况。

图10为过表达hsa-mir-449a后检测成球(a)和克隆形成(b)能力。

图11为过表达hsa-mir-449a后nod/scid小鼠皮下移植瘤的图片(a)和重量(b)，接种细胞数为1×10⁴个细胞。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明使用的肝癌干细胞模型由本实验室构建，该模型含有nanog启动子调控gfp报告基因构建的慢病毒表达载体(nanog-gfp报告系统)，其构建方法参见shanetal.2012,hepatology,56:1014-1014。

lv-sh-scramble(lv-sh-nc)和lv-sh-mir449a质粒由本实验室构建，具体参见shanetal.2012,hepatology,56:1014-1014；hek293t细胞由本实验室保存。

人原发性肝癌细胞系plc/prf/5购自中国科学院上海细胞所；plc/prf/5索拉菲尼耐药细胞株(记为plc/prf/5dr3)由本实验构建。envision^tm和dab显色液购自丹麦dako公司。

实施例1检测hsa-mir-449a在肝癌干细胞样细胞群中的表达

采用成球培养的方法将人原发性肝癌细胞系plc/prf/5，培养成细胞球样细胞，记为plc/prf/5sphere；用流式细胞仪分别分选nanog阳性的肝癌干细胞(记为nanog^pos)和nanog阴性的非肝癌干细胞(记为nanog^neg)。通过rt-pcr分别检测plc/prf/5sphere；nanog^pos和nanog^neg细胞及本实验室构建的索拉菲尼耐药细胞株plc/prf/5drugresistance中hsa-mir-449a的表达情况。

实验结果如图1所示：hsa-mir-449a在nanog阳性的肝癌干细胞(记为nanog^pos)和索拉菲尼耐药细胞株中高表达，提示hsa-mir-449a可能为癌基因，并且和肝癌干细胞调控相关。

实施例2干扰hsa-mir-449a表达试剂的构建方法

shrna在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，可以识别靶mrna并降解。

(1)慢病毒lv-sh-mir-449a和lv-sh-nc的包装

在10cm的培养皿中铺2～5×10⁶个293t细胞，培养液含10％fbs的dmem(v/v)，待细胞汇合至70％时，换新鲜的含10％fbs的dmem(v/v)培养液，3-4h后用于转染。

取15-20μg的plv-sh-mir-449a和plv-sh-nc慢病毒表达质粒，向混合液中分别滴加50ul2.5m的cacl2，再分别加入无菌水至总体积500μl，混匀后加入500μl2×hbs缓冲液，滴加结束后震荡混匀，室温放置5分钟后，将液体加入培养的hek293t中混匀，6-12小时后换新鲜的10％fbs的dmem(v/v)培养液。

(2)慢病毒lv-sh-mir-449a和lv-sh-nc的收集和纯化

自转染开始后48小时、72小时各收集一次细胞培液，48小时收集后，再补充15ml的培液，将收集的病毒在1000rpm条件下离心10min去除细胞碎片，收集上清，并用0.45μm的滤膜过滤，滤液转移入millopore的浓缩柱，在5000rpm离心至上层凹槽内的液体体积浓缩至1ml(可分多次加入)。将浓缩液分装，置于-80℃低温冰箱保存。

获得的慢病毒载体lv-sh-mir-449a图谱如图2所示。sh-mir449a是针对mir449a的功能区(比如cdr)序列设计的shrna。

实施例3干扰hsa-mir-449a的nanog^pos的肝癌干细胞构建

依据实施例1的方法分选nanog^pos肝癌干细胞，然后种植在6孔板内，待细胞长至1×10⁶时，分别加入慢病毒lv-sh-mir-449a和lv-sh-nc颗粒，72小时后qrt-pcr检测hsa-mir-449a的干扰效率。结果如图3所示lv-sh-mir-449a对nanog^pos肝癌干细胞有较高的干扰效率，并且得到了干扰hsa-mir-449a后的nanog^pos肝癌干细胞。

实施例4干扰hsa-mir-449a的表达后肝癌干细胞自我更新的检测。

(1)克隆形成检测

将感染lv-sh-mir-449a和lv-sh-nc慢病毒72h后的plc/prf/5nanog^pos肝癌干细胞分别计数200个接种于24孔板(设置3个重复)，培养14天后观察克隆形成能力，分别计数克隆形成数，结果如图4所示。结果表明，转染lv-sh-mir-449a慢病毒的肝癌干细胞所成的克隆大小数目(17.25±1.9％)明显小于对照细胞(27.75±4.3％)，且两者差异显著(p<0.005)，表明干扰hsa-mir-449a的表达会降低肝癌干细胞克隆形成能力。

(2)成球检测

为进一步研究干扰hsa-mir-449a的表达对肝癌干细胞成球能力的影响，分别将感染lv-sh-mir-449a和lv-sh-nc的慢病毒72h后的肝癌干细胞分别计数10个细胞接种于96孔板，设置8个重复，培养14天观察肝癌干细胞成球能力。通过显微镜观察及计数，结果如图5所示。结果发现，在肝癌干细胞中干扰hsa-mir-449a表达的成球数目(平均数为13.3±8.0％)与对照组细胞相比成球体积小且数目少(平均数为35.0±10.5％)，且两者差异显著(p<0.003)，说明干扰hsa-mir-449a表达能够抑制细胞的成球生长能力。

肿瘤干细胞的克隆形成和成球能力是检测肿瘤干细胞自我更新能力的重要指标，综上所述干扰hsa-mir-449a的表达可以抑制肝癌干细胞的自我更新能力。

实施例5干扰hsa-mir-449a的表达后肝癌干细胞动物实验。

(1)成瘤能力检测

利用实施例2构建的plc/prf/5-nanog^pos-shnc和plc/prf/5-nanog^pos-sh449a细胞分别以1×10²、1×10³、1×10⁴数量分别接种于免疫缺陷nod/scid皮下建立皮下移植瘤模型，每组5只小鼠。接种感染慢病毒细胞后2周，每2日观察nod/scid鼠的肿瘤生长状态，记录小鼠生长情况、成瘤率、测量肿瘤生长状况(大小)。接种感染慢病毒细胞4-9周后依次处理小鼠，照相，收集移植瘤，并测量肿瘤体积和重量，一部分保存液氮灌，一部分提取组织蛋白，剩余组织用4％多聚甲醛固定，并进行石蜡包埋切片。

小鼠肿瘤生长状况(重量)统计图如图6所示，干扰hsa-mir-449a表达的plc/prf/5-nanog^pos-sh449a细胞与对照细胞相比有更低的成瘤率，平均肿瘤大小为0.0568远小于对照组平均肿瘤大小0.857，p＝0.0124差异显著。小鼠成瘤率的统计如图8所示，在10²数量级时plc/prf/5-nanog^pos-sh449a细胞成瘤率为60％低于对照组100％的成瘤率，利用在线软件http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/分析，计算其中具有肝癌干细胞比例，结果显示对照组每一个细胞均为肝癌干细胞能够发挥干细胞功能成瘤，而plc/prf/5-nanog^pos-sh449a细胞组每360个细胞中仅有一个能够发挥肝癌干细胞功能成瘤。

(2)免疫组化检测nanog和ki-67在移植瘤的表达水平

取接种感染慢病毒细胞4周的肿瘤组织，分别进行h&e染色和免疫组化检测nanog和ki67的表达，结果如图7所示。由图可知，对照组高表达nanog和ki67，干扰hsa-mir-449a表达后表达nanog和ki67表达量显著降低。

上述结果表明了干扰hsa-mir-449a表达能够抑制肝癌干细胞的自我更新能力和肿瘤生长。

为了进一步验证hsa-mir-449a对肝癌干细胞的影响，发明人在nanog^neg细胞中过表达hsa-mir-449a，验证在非肝癌干细胞中过表达hsa-mir-449a后是否会影响非肝癌干细胞的自我更新能力。具体实施方式与实施例1相同，不再进行赘述。

实验结果如图8，图9，图10，图11所示，在非肝癌干细胞中过表达hsa-mir-449a后可以增加非肝癌干细胞的自我更新能力和肿瘤生长，过表达hsa-mir-449a的非肝癌干细胞具有等同于肝癌干细胞的能力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>重庆精准生物技术有限公司

<120>干扰hsa-mir-449a表达的试剂及其应用

<160>3

<210>1

<211>91

<212>rna

<213>未知

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<221>hsa-mir-449a

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<213>人工序列

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<221>sh-mir-449a

<222>

<223>

<400>

ccggaccagctaacaatacactgccatcaagagtggcagtgtattgttagctggtttttt60

t61

<210>3

<211>1637

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>表达载体

<222>

<223>

<400>

tttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattgga60

attaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataa120

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