一种枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽及其应用。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，可内生抗逆孢子，细胞壁的组成结构简单，不含内毒素；仅有单层外膜，当分泌蛋白通过细胞膜，并在细胞间质进行加工折叠后，便直接释放进入培养液中；遗传背景清晰，已完成全基因组测序，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌(escherichiacoli)；发酵简单，对营养无特殊要求，在规模化生产中能够保持较高的细菌浓度，因此其在工业酶的生产有着广泛应用。

基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽是位于新生分泌蛋白质及细胞膜蛋白n端的一段特有的氨基酸序列，它对于蛋白的跨膜分泌效率有着重大的影响。信号肽序列一般不具有明显的氨基酸序列保守性，一般由带有正电荷的n结构域、富含疏水氨基酸的h结构域以及带有负电荷的c结构域组成。在枯草芽孢杆菌表达系统中，来源于革兰氏阳性菌的蛋白一般都能利用自身信号肽有效表达分泌，其表达产物对宿主菌的蛋白酶也有一定的耐受性，但是异源蛋白的分泌表达则较困难，通常都要与芽孢杆菌胞外蛋白启动子和信号序列融合才能使分泌表达有效进行。因此，研究枯草芽孢杆菌自身不同种类的信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽。

本发明的另一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽的编码基因。

本发明的又一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

编码所述枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽的基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：

(a)如seqidno.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；

(b)对seqidno.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与seqidno.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。

含上述任一所述枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽的基因的重组表达载体、重组基因工程菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述的重组基因工程菌为将上述任一所述枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽的基因融合到需要表达基因的n端，使融合后的基因编码的蛋白的n端融合有相应信号肽；优选为分泌β-半乳糖苷酶能力提高的基因工程菌；或为能分泌转谷氨酰胺酶的基因工程菌；更优选为枯草芽孢杆菌基因工程菌。

所述的枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽在提高目的蛋白分泌表达中的应用。

所述的目的蛋白为耐热β-半乳糖苷酶或转谷氨酰胺酶。

所述的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达；优选为在枯草芽孢杆菌中分泌表达。

所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌atcc6051(b.subtilisatcc6051)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，筛选出能提高β-半乳糖苷酶分泌的信号肽。同时构建该信号肽与转谷氨酰胺酶酶原编码基因相结合的表达载体，实现了转谷氨酰胺酶酶原的分泌表达。

2、本发明提供了一种氨基酸片段，具有很强的分泌表达活性的信号肽，能实现外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。

3、本发明通过融合信号肽，可以使β-半乳糖苷酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。

4、本发明通过融合信号肽，实现转谷氨酰胺酶酶原分泌表达。

附图说明

图1是实施例1中扩增biobrick的pcr产物电泳图；其中，泳道m为markerdna，泳道1为biobrick的pcr扩增产物。

图2是实施例1中质粒pbep43s-biobrick-bgab和质粒pbep43-sp-bgab构建示意图。

图3是实施例2中扩增sppgse片段电泳图；其中，泳道m：markerdna；泳道1为sppgse片段。

图4是实施例2中表达质粒pbep43-sppgse–promtg的构建示意图。

图5是实施例2中b.subtilisatcc6051(pbep43-sppgse-promtg)表达的sds-page电泳胶图；其中，泳道m：marker；泳道1为b.subtilisatcc6051；泳道2为b.subtilisatcc6051(pbep43-sppgse-promtg)；箭头表示目的蛋白mtg的位置。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括pcr扩增、质粒提取、dna片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw,janssenk,argentinej.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社)。

实施例1β-半乳糖苷酶高效分泌表达的信号肽的筛选

参考(christiandegeringet.al,2010)的方法，通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因(bgab)相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，从克隆中获得不同程度提高β-半乳糖苷酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：

(1)构建pbep43-biobrick-bgab载体：以两段人工合成片段seqidno.3、seqidno.4退火延伸得到的biobrick(生物积木)的pcr片段带有酶切位点kpnⅰ和xhoⅰ，用限制性内切酶消化并纯化的100bp大小的pcr产物(如图1)插入质粒pbe-p43-bgab(按专利文献：潘力等.一种具有启动子功能的dna片段与应用.cn201510074949.0[p].2015.构建)相同内切酶位置，得到pbep43s-biobrick-bgab质粒(如图2)，设计的biobrick的pcr片段如seqidno.5所示。扩增的pcr片段碱基序列由sanger测序确认。

(2)构建pbep43-sp(signalpeptidedatabase)-bgab载体：提取枯草芽孢杆菌(bacillussubttlis168，购于广东省微生物菌种保藏中心)基因组dna(omega细菌基因组dna抽提试剂盒)，使用相应引物(f-sppgse：5′-gagaggaatgtcgacatgaaatttgtcaaagccatctggc-3′；r-sppgse：5′-cgttgtccatctcgagagctgacataaacaagaacacgat-3′)选取信号肽dna进行扩增，将pcr产物回收(omegadna凝胶回收试剂盒)，经过克隆转化插入上述构建好的pbep43-biobrick-bgab载体中，使用酶切位点为kpnⅰ和xhoⅰ，构建成pbep43-sp-bgab载体(如图2)。

(3)将构建好的pbep43-sp-bgab载体通过电转到化枯草芽胞杆菌b.subtilisatcc6051，具体方法参考非专利文献记录(nataliap，zakataeva，oksanavetal.asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationintochromosomeofnaturallynontransformablebacillusamyloliquefaciensstrains[j].applmicrobiolbiotechnol.2010,85:1201-1209)，于抗性平板(卡那霉素20μg/ml)上获得克隆子。

(4)挑取克隆子使用96孔板培养，通过测定β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活，确定分泌优化的克隆子。β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活的测定：将32μl培养液与288μl0.25％onpg(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside,邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷)混合，55℃下温育15min，反应终止加入320μl的(w/w)na2co3。反应呈显色反应，在405nm波长下测定吸光值。

(5)对分泌优化克隆子进行测序，确定信号肽是否被修改。经过上述步骤筛选获得能提高β-半乳糖苷酶分泌效果的信号肽，在ncbi核对后为pgse基因的信号肽，氨基酸序列为：mkfvkaiwpfvavaivflfmsa(seqidno.1)，编码该氨基酸序列的核苷酸序列为：atgaaatttgtcaaagccatctggccgtttgttgccgtagccatcgtgttcttgtttatgtcagct(seqidno.2)。

实施例2信号肽表达水平的检测

(1)构建mtg(转谷氨酰胺酶)胞外表达质粒：以质粒pbep43-promtg(按专利文献：潘力等.一株重组的枯草芽孢杆菌及其生产转谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.构建)为表达质粒，以上述实施例1得到的pbep43-sppgse-bgab质粒为模板，引物f-sppgse(5′-gagaggaatgtcgacatgaaatttgtcaaagccatctggc-3′)、r-sppgse(5′-cgttgtccatctcgagagctgacataaacaagaacacgat-3′)扩增约100bpsppgse片段(见图3)。用in-fusion方法(具体操作方法见nebuilder公司的hifidnaassemblymastermix)将信号肽(sppgse片段)和质粒(pbep43-promtg)连接，构建得到mtg表达胞外质粒pbep43-sppgse-promtg(见图4)。先用化学转化法转化至大肠杆菌(e.colijm110)，得到阳性克隆子，经测序后提取质粒，用电转化的方法转化至枯草芽孢杆菌b.subtilisatcc6051。

(2)将得到的转化子b.subtilisatcc6051(pbep43-sppgse-bgab)和b.subtilisatcc6051(pbep43-sppgse-promtg)培养于10mllb培养基中(卡那霉素20μg/ml)，37℃，200rpm活化12h，将活化的种子液接种于50mllb培养基中(卡那霉素20μg/ml，1％(w/w)葡萄糖)接种量为1％(体积比)，37℃，200rpm总发酵48h，每隔6小时取样。

(3)β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活的测定：结果表明信号肽sppgse分泌的β-葡萄糖半乳糖苷酶表达，酶活在30～48h的表达最高，其中36h达到最高酶活6.64u/ml。

(4)sds-page：将b.subtilisatcc6051(pbep43-sppgse-promtg)培养了36h的发酵液离心取上清，上清液跑sds-page电泳，与野生型枯草芽孢杆菌b.subtilisatcc6051作为对照，蛋白胶图显示在44-46kda有条带和mtg蛋白大小一致，而野生型对照在此大小范围内无条带，实验结果说明mtg蛋白酶原得到表达(见图5)。说明sppgse可作为有效信号肽作用于枯草芽孢杆菌。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一种枯草芽孢杆菌可用于提高分泌效率的信号肽及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>信号肽

<400>1

metlysphevallysalailetrpprophevalalavalalaileval

151015

pheleuphemetserala

20

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>信号肽的编码基因

<400>2

atgaaatttgtcaaagccatctggccgtttgttgccgtagccatcgtgttcttgtttatg60

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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