本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株ss0716及其分泌的能识别二甲氧苄啶的单克隆抗体，可用于食品中二甲氧苄啶残留的检测，属于免疫化学技术领域。
背景技术：
二甲氧苄啶是一种常用的磺胺抗菌增效剂，在分类上属于二氨基嘧啶类化学合成抗菌药，并且是动物专用。早期研究发现该药物与磺胺类抗生素合用可使磺胺类药物抗菌谱扩大、抗菌活性大大增强，甚至使磺胺类抗生素的抑菌作用变成杀菌作用，所以被成为“磺胺增效剂”。二甲氧苄啶本身具有抗菌活性，临床上主要是与磺胺类药物复配用于治疗畜禽的胃肠道、呼吸道、尿道等细菌感染及球虫感染，近年来，有研究表明该化合物还可以增强多种抗生素类药物和多种中药的疗效。但是该药物的长期使用，甚至是乱用、滥用，会造成动物性食品中的药物残留。同时也会导致部分细菌耐药性的出现。目前，仅有日本规定二甲氧苄啶在鸡可食性组织（肌肉、肝脏、肾脏和脂肪）中的最高残留量为50μg/kg，其它各国及国际组织均未对二甲氧苄啶制定食品安全标准。对于动物养殖业中二甲氧苄啶使用的监管，以及对动物性食品中二甲氧苄啶的残留检测并进行监督十分重要。
目前，对于二甲氧苄啶的检测方法主要是依靠仪器分析，例如液相色谱等。但是这些方法需要依靠昂贵的仪器设备，检测时间长，需要专业的人员来操作。酶联免疫分析方法（elisa）是一种基于单克隆抗体的快速并且灵敏的高通量检测方法，对于食品中的药物残留检测具有重要意义。目前没有关于抗二甲氧苄啶单克隆抗体的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是开发针对二甲氧苄啶的单克隆抗体，并在此基础上建立elisa方法。此发明内容包括两个方面：单克隆抗体的制备和其应用。
抗二甲氧苄啶单克隆抗体是通过小鼠免疫二甲氧苄啶免疫原获得。免疫原和包被原都是通过戊二醛方法合成。第五次免疫后，筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，将脾细胞与sp2/0瘤细胞融合。融合后用间接elisa方法检测细胞上清，筛选对阳性高且对二甲氧苄啶抑制好的细胞进行亚克隆，进行三次亚克隆后获得纯的细胞株。将细胞株扩大培养后注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔内制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对二甲氧苄啶的半数抑制浓度(ic50)，以及对其结构类似物的ic50，计算交叉反应率。将二甲氧苄啶药物添加入牛奶中，进行样本添加回收实验，计算回收率。
本发明的技术方案：一株分泌抗二甲氧苄啶单克隆抗体的杂交瘤细胞株ss0716，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14686。
抗二甲氧苄啶单克隆抗体，由所述保藏编号为cgmccno.14686的杂交瘤细胞ss0716分泌产生，其ic50为0.58μg/l。
所述的抗二甲氧苄啶单克隆抗体的应用，用于对食品中二甲氧苄啶残留的检测。
本发明的有益效果：采用间接竞争elisa测定细胞株ss0716分泌的单克隆抗体，对二甲氧苄啶的ic50为0.58μg/l。对牛奶及蜂蜜中二甲氧苄啶的回收率范围为98.71%～104.01%及94.07%～98.68%。为动物性食品中二甲氧苄啶残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：单克隆细胞株ss0716，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.14686，保藏日期2017年9月5日。
附图说明
图1ss0716分泌的单克隆抗体对二甲氧苄啶的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：免疫原和包被原合成
免疫原和包被原均通过戊二醛方法合成：5mg二甲氧苄啶溶解于2ml甲醇溶液中，用1mhcl调ph至4。将5.67μl25%戊二醛水溶液加入二甲氧苄啶溶液中，室温搅拌活化30min。20mg血蓝蛋白溶解于4ml0.01mpbs中,将活化好的二甲氧苄啶缓慢加入蛋白溶液中，室温搅拌反应4h。反应结束后，反应物用0.01mpbs溶液透析三天，得到的免疫原分装保存在-20℃。包被原的合成与免疫原的合成方法相同，将血蓝蛋白换成卵清白蛋白即可。
实施例2：小鼠免疫
免疫原用生理盐水稀释到合适的浓度，再与等量的弗氏完全佐剂乳化，在6-8周龄的balb/c小鼠的背上进行多点注射。首次免疫用的是弗氏完全佐剂，免疫剂量为100μg。后面的加强免疫中，免疫原与弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量为50μg，免疫间隔为21天。第三次免疫后，通过小鼠的尾静脉采血，并通过间接elisa来检测血清。第五次免疫后筛选效价高抑制好的小鼠进行腹腔冲刺免疫，三天以后取出小鼠脾脏进行细胞融合。
实施例3：细胞融合与筛选
小鼠脾细胞和瘤细胞在peg1500的作用下融合形成杂交瘤细胞。融合后第七天进行检测，筛选效价高且对二甲氧苄啶识别性好的细胞株进行亚克隆，以此类推，进行3次亚克隆获得纯的细胞株。
实施例4：单克隆抗体的纯化
筛选出的细胞株扩大培养后，注射进已经打过石蜡油的小鼠腹腔内，7到14天后可以从小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化，储存在-20℃。
实施例5：单克隆抗体的性质
抗体的灵敏度和特异性通过间接elisa来测定。
1、单克隆抗体的交叉反应率
首先通过棋盘法确定包被抗原和单克隆抗体反应的最佳浓度。再用间接elisa方法测定单克隆抗体的交叉反应率。具体步骤为：将包被原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液稀释，100μl/孔，37℃反应2h。将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液pbst洗涤3次，每次3min。拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。酶标板的每孔里加入50μl标准物溶液和50μl抗体，在37℃下培养30min后洗涤三次后拍干，每孔加入1︰3000稀释二抗100μl，在37℃下培养30min后洗涤4次后拍干，加入已配制好的tmb显色液100μl，37℃培养15min,最后每孔加入50μl2m硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定在450nm处的吸光值。
测定了单克隆抗体对其他增效剂的ic50：甲氧苄啶、奥美普林和巴喹普林。交叉反应率为类似物的ic50与二甲氧苄啶ic50的比值。其交叉实验结果如表1所示。
表1.单克隆抗体ss0716的交叉
2、添加回收实验
向阴性牛奶及蜂蜜中分别添加不同浓度的二甲氧苄啶，间接竞争elisa来测定添加样本中的目标物浓度。牛奶样本稀释5倍，蜂蜜样本稀释10倍来排除基质干扰，计算回收率。添加回收实验结果见表2。
表2.添加回收实验
溶液配制：
碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐温20的pbs；
tmb显色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1︰5混合即为tmb显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。