一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体的制作方法

本发明涉及一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于酶工程领域。

背景技术：

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,ec2.3.2.13,tgase)，可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。tgase在食品加工领域的应用广泛，比如，tgase可使蛋白质与必须氨基酸(如赖氨酸)交联，提升一些食品的营养价值。tgase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，tgase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。

微生物具有生产成本低、易于培养和改造等优点，所以生产上主要依赖微生物来生产tgase。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原(pro-mtg)的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除n-端酶原区(pro)才能转化成活性mtg。酶原区(pro)位于信号肽与成熟酶之间，属于前导肽，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。有些链霉菌如streptomyceslividans3113、streptomycesladakanum等，其自身可以表达活化mtg的蛋白酶，因而可以表达活性mtg，但是mtg酶活相对较低，普遍在1.0-6.0u/ml。

近年来利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌等异源宿主中表达mtg成为了一种新的趋势，然而，一方面，大肠杆菌等异源宿主是非食品级表达体系，另一方面，在异源宿主中，谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原的形式分泌，需在体外经蛋白酶tamep，sam-p45，dispase等切除n-端酶原区(pro)才能转化成活性谷氨酰胺转氨酶。且重组菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量普遍较低，如刘松的《overproductionofpro-transglutaminasefromstreptomyceshygroscopicusinyarrowialipolyticaanditsbiochemicalcharacterization》中将吸水链霉菌来源的pro-tgase的突变体n355q异源表达得到重组菌产量可达35u/ml，重组菌产谷氨酰胺转氨酶的产量有提升较小。因此，如何在食品级表达体系中稳定、的直接表达谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。另外，如果在异源宿主中可以直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本，一举两得。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体。

本发明第一个目的是提供一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达所述突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。

本发明第三个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法是，具体步骤如下：

(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pina1297/hpro-mtg，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如seqidno.2，所述吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro的氨基酸序列如seqidno.3所示。

(2)重组质粒pina1297/hpro-mtg线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基ynb筛选后，获得重组菌po1h/hpro-mtg。

本发明的第四个目的是提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌，所述重组菌共表达蛋白酶tamep和hpro-mtg，所述蛋白酶tamep的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述hpro-mtg的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第五个目的是提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌的构建方法，具体步骤如下：

将氨基酸序列为seqidno.4的蛋白酶tamep的基因构建质粒pina1297/ht，将质粒线性化后转化到重组菌po1h/hpro-mtg中，经营养缺陷型培养基ynb筛选后，得到表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/hm+ht。

本发明第六个目的是提供一种所述重组菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，所述方法的步骤如下：

(1)摇瓶培养：将重组菌接种于ypd液体培养基中，培养25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25℃-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。

(2)发酵罐培养方法：将重组菌接种于ypd液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(w/v)甘油120ml，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。

重组菌po1h/hpro-mtg接种于ypd液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(w/v)甘油120ml，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活最高可达43.7u/ml。

本发明的有益效果：

1.本发明通过改造茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区，得到了一种高产谷氨酰胺转氨酶的突变体，摇瓶发酵酶活可达11.7u/ml，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7u/ml，为目前所报道的最高水平；通过共表达蛋白酶tamep和hpro-mtg，摇瓶发酵酶活可达6.7u/ml，发酵罐发酵酶活达到21.4u/ml，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，无需经酶切处理，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本。

2.解脂耶氏酵母为食品级表达体系(已被fda认定是安全的)，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产。易于培养，发酵方法简单，周期短。高密度发酵，分泌能力强，利于大量表达谷氨酰胺转氨酶。本发明采用的po1h系的解脂耶氏酵母已敲除胞外蛋白酶基因，所以胞外几乎无杂蛋白，易于谷氨酰胺转氨酶的分离纯化。

3.本发明使用的谷氨酰胺转氨酶基因来源于茂源链霉菌，ph适应范围广，稳定性高(ph适应范围为5-9，最适反应ph范围为6-7，最适反应温度为55℃)。

附图说明

图1：重组菌发酵mtg酶活

图2：重组菌发酵上清sds-page图

图3：活性表达重组菌产mtg酶活

图4：活性表达mtg重组菌发酵上清sds-page图

具体实施方式

培养基：

lb培养基：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l。

ypd培养基：yeastextract10g/l，tryptone20g/l，葡萄糖20g/l。

ynb培养基：ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l。

固体培养基则是在液体培养基中加2％的琼脂。

发酵培养基：甘油15g/l，酵母粉20g/l，氯化铵2.64g/l，磷酸二氢钾0.32g/l，无水硫酸镁0.25g/l，维生素b13.34×10^-4g/l，调节ph至8.0。

promtg的体外活化：

取40μl发酵上清，加入2μl中性蛋白酶dispase(0.1mg/ml)，用旋涡振荡仪混匀，37℃保温20min。

谷氨酰胺转氨酶酶活力的测定：

采用比色法测定谷氨酰胺转氨酶酶活。1个单位的酶活定义为：在37℃的条件下,每分钟催化α-n-cbz-gln-gly合成1μmol的l-谷氨酸-γ-单轻胺酸所用的酶量(u/ml)。酶活测定条件：在37℃条件下，40μl发酵上清液，100μl30mmα-n-cbz-gln-gly反应10min，加入40μl终止剂(3mhcl，12％三氯乙酸，5％fecl3)终止反应。在525nm处测定吸光值，通过l-谷氨酸-γ-单轻胺酸绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。

mtg纯化方法：

发酵液于5000rpm，4℃条件下离心20min，收集上清液。上清液转移至透析袋中，于ph5.0的0.05mol/l醋酸盐缓冲液中低温(4℃)透析12h，然后过0.22μm滤膜，并将样品收集至洁净的试管中。ph5.0的0.05mol/l醋酸盐缓冲液平衡强阳离子交换柱fractogelemdso3^-，进样，之后继续用ph5.0的0.05mol/l醋酸盐缓冲液洗下与柱子结合不牢的杂蛋白，然后用含有0-1.0mol/lnacl的醋酸盐缓冲液(ph5.0，0.05mol/l)洗脱，在出峰处收集目的蛋白mtg。

实施例1重组菌po1h/hpro-mtg的构建

以实验室保留的质粒pina1297/n355q为模板，p1和p2为引物进行pcr，通过pcr扩增含有hpro酶原区的1297表达载体。pcr扩增体系为：模板1μl，上下游引物各1μl，primestar25μl，双蒸水22μl。pcr条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃5min30s，72℃20min，30个循环。以实验室保留的质粒pet20b/mpro-mtg为模板，p3和p4为引物进行pcr，通过pcr扩增含有mtg的基因片段。pcr扩增体系同上，pcr条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃1min20s，72℃10min，30个循环。两种pcr产物经dpni消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1:2进行混合，使用onestepcloningkit进行连接后，转化e.colijm109，菌落pcr筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到lb液体培养基中，37℃，培养12h,交由上海生工进行测序，测序正确即说明重组菌pina1297/hpro-mtg构建成功。将重组质粒pina1297/hpro-mtg经快切酶noti线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基ynb筛选后，获得重组菌po1h/hpro-mtg。

表1引物

实施例2重组菌po1h/mpro-mtg的构建

质粒pina1297/n355q经快切酶sfii，bamhi酶切后进行胶回收，得到线性化的pina1297基因片段。以实验室保留的质粒pet20b/mpro-mtg为模板，p5和p4为引物进行pcr，通过pcr扩增mpro-mtg的基因片段。pcr扩增体系同实施例1，pcr条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃1min20s，72℃10min，30个循环。pcr产物经dpni消化后进行胶回收，得到mpro-mtg的基因片段。pina1297基因片段与mpro-mtg的基因片段以摩尔比为1:2进行混合，使用onestepcloningkit进行连接后，转化e.colijm109，菌落pcr筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到lb液体培养基中，37℃，培养12h,交由上海生工进行测序，测序正确即说明重组菌pina1297/mpro-mtg构建成功。将重组质粒pina1297/mpro-mtg经快切酶noti线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基ynb筛选后，获得重组菌po1h/mpro-mtg。

实施例3重组菌po1h/hpro-mtg和重组菌po1h/mpro-mtg摇瓶发酵

将实施例1中构建的重组菌hpro-mtg与实施例2构建的重组菌po1h/mpro-mtg分别接种于ypd液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶(规格：250ml)培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。检测发现酶活分别为11.7u/ml和0.11u/ml。重组菌po1h/hpro-mtg，酶原区替换为hpro后酶活较对照提高了106倍(图1)。sds-page的结果进一步论证了酶原区替换为hpro能显著提高谷氨酰胺转氨酶的分泌表达量(图2)。

实施例4重组菌po1h/hpro-mtg发酵罐发酵

重组菌po1h/hpro-mtg接种于ypd液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(w/v)甘油120ml，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活最高可达43.7u/ml。

实施例5：表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/hm+ht的构建

以实验室保留的质粒pina1297/n355q为模板，p1和p2为引物进行pcr，通过pcr扩增含有hpro酶原区的1297表达载体。pcr扩增体系为：模板1μl，上下游引物各1μl，primestar25μl，双蒸水22μl。pcr条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃5min30s，72℃20min，30个循环。以实验室保留的质粒pina1297/tamep-q为模板，p6和p7为引物进行pcr，通过pcr扩增tamep基因。pcr扩增体系同上，pcr条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃2min25s，72℃10min，30个循环。两种pcr产物经dpni消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1:2进行混合，使用onestepcloningkit进行连接后，转化e.colijm109，菌落pcr筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到lb液体培养基中，37℃，培养12h，交由上海生工进行测序，测序正确即说明重组菌pina1297/ht构建成功。将重组质粒pina1297/ht经快切酶noti线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母重组菌hpro-mtg，经营养缺陷型培养基ynb筛选及菌落pcr验证后，获得一株表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/hm+ht。

实施例6重组菌po1h/hm+ht摇瓶发酵

将重组菌po1h/hm+ht种于ypd液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，次日按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，检测发现胞外酶活最高达到了6.768u/ml(图1)。sds-page的结果进一步论证了共表达tamep与hpro-mtg能实现谷氨酰胺转氨酶在解脂耶氏酵母中的活性表达。

实施例7重组菌po1h/hm+ht发酵罐发酵

重组菌po1h/hm+ht接种于ypd液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(w/v)甘油120ml，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。

经检测酶活最高可达21.4u/ml。

实施例8酶学性质

对纯化谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质方面的研究，具体见表2(mpro-mtg的酶活性质参考刘松的《arapidandsimplemethodforthepurificationoftransglutaminasefromstreptoverticilliummobaraense》)。可以看出，重组菌hpro-mtg与野生菌相比比酶活有较大提高，km值变大。活性表达重组菌hm+ht与hpro-mtg各方面的性质相似，无太大变化。

表2酶学性质

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>388

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

alaserglyaspaspglugluarggluglysertyralagluthrhis

151015

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740745750

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755

<210>5

<211>376

<212>prt

<213>人工合成

<400>5

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151015

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<213>人工合成，引物序列

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<213>人工合成，引物序列

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<213>人工合成，引物序列

<400>8

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<210>9

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<213>人工合成，引物序列

<400>9

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<210>10

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<212>dna

<213>人工合成，引物序列

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<213>人工合成，引物序列

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<213>人工合成，引物序列

<400>12

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