本发明属于生物医药和试剂检测技术领域,涉及一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒。具体涉及一种用于筛查克拉霉素所致皮肤药物不良反应的人类白细胞抗原基因检测试剂盒；本发明涉及的人类白细胞抗原基因--hla-a*02:07基因，其与克拉霉素所致的皮肤药物不良反应(cutaneousadversereactions,cadrs)发病相关。
背景技术：
现有技术公开了皮肤药物不良反应即药疹，指药物通过各种途径进入人体后引起的皮肤黏膜炎症反应。临床根据皮疹表现的不同，分为普通药疹和重症药疹(severecutaneousadversereactions,scadrs)，普通药疹又分为固定性红斑型(fixeddrugeruption,fde)、发疹型(maculopapularexanthems,mpe)、荨麻疹型(urticaria)等，重症药疹主要包括重症多形红斑型(steven-johnsonsyndrome,sjs)、大疱表皮坏死松解型(toxicepidermalnecrolysis,ten)、dress综合症(drugreactionwitheosinophiliaandsystemicsymptoms)和急性泛发性发疹型脓疱病(acutegeneralizedexanthematouspustulosis,agep)。(pichler,w.j.,etal.,drughypersensitivityreactions:pathomechanismandclinicalsymptoms.medclinnortham,2010.94(4):p.645-64,xv.)临床实践显示，药疹死亡率高，救治中常使用大剂量激素、免疫抑制剂和静脉丙种球蛋白，不但给患者带来极大的身心痛苦，并浪费巨大的社会资源。
克拉霉素(6-o-甲基红霉素)为大环内酯类抗生素，临床上用以治疗各种细菌感染，包括流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等。(knoben,j.e.,phillips,s.j.newdruginformationresourcesforpharmacistsatthenationallibraryofmedicine.jampharmassoc(2003).54,49-55(2014).phougat,n.etal.combinationtherapy:thepropitiousrationalefordrugdevelopment.combchemhighthroughputscreen.17,53-67(2014).)还被推荐为四联疗法治疗幽门螺旋杆菌感染，有研究报道幽门螺寻杆菌常导致消化道溃疡和胃癌的发生。(venerito,m.,krieger,t.,ecker,t.,leandro,g.,malfertheiner,p.meta-analysisofbismuthquadrupletherapyversusclarithromycintripletherapyforempiricprimarytreatmentofhelicobacterpyloriinfection.digestion.88,33-45(2013).pellicano,r.etal.a2016panoramaofhelicobacterpyloriinfection:keymessagesforclinicians.panminervamed.58,304-317(2016).)还有研究显示，克拉霉素是引起皮肤药物不良反应cadrs的常见药物。(whomodellistofessentialmedicines,april2015,19thversioninhttp://www.who.int/medicines/publications/essentialmedicines/eml_2015_final_amended_nov2015.pdf？ua＝1.)。
人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)基因的表达产物为人类白细胞抗原，后者在免疫反应中担任至关重要的角色。已有研究发现包括卡马西平、阿巴卡韦、别嘌呤醇等在内的数种药物引起的药疹与hla等位基因相关(bharadwaj,m.,etal.,drughypersensitivityandhumanleukocyteantigensofthemajorhistocompatibilitycomplex.annurevpharmacoltoxicol,2012.52:p.401-31.cao,z.h.,etal.,hla-b*58:01alleleisassociatedwithaugmentedriskforbothmildandseverecutaneousadversereactionsinducedbyallopurinolinhanchinese.pharmacogenomics,2012.13(10):p.1193-201.roujeau,j.c.,etal.,geneticsusceptibilitytotoxicepidermalnecrolysis.archdermatol,1987.123(9):p.1171-3.)。
经对现有技术文献的检索发现，国内外至今未见关于hla-a*02:07基因与克拉霉素引cadrs发病相关以及可作为基因标记用于筛选药疹的相关报道，基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及其用途。
技术实现要素：
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种人类白细胞抗原基因(hla-a*02:07基因)检测试剂盒及其用途，具体涉及一种用于筛查克拉霉素所致皮肤药物不良反应的人类白细胞抗原基因检测试剂盒；本发明涉及的人类白细胞抗原基因--hla-a*02:07基因，其与克拉霉素所致的皮肤药物不良反应(cutaneousadversereactions,cadrs)发病相关。
具体的，本发明提供了一种检测hla-a*02:07基因的试剂盒及其使用方法。
本发明进一步提供了上述试剂盒的用途，本发明中通过检测hla-a*02:07基因的存在评估患者服用克拉霉素后是否具有患cadrs的潜在可能；同时可以据此指导临床用药，从而减少克拉霉素所致cadrs的发生。
更具体的，本发明提供了一种人类白细胞抗原基因的检测试剂盒，
所述的人类白细胞抗原基因是hla-a*02:07基因；
所述的试剂盒中含有检测人类白细胞抗原基因的核酸或者蛋白的试剂；
所述的试剂盒中还含有人类白细胞抗原基因的扩增引物；或者标记探针；
或者,所述的试剂盒中含有人类白细胞抗原基因的特异性抗体。
本发明所述克拉霉素所致cadrs的相关hla等位基因-hla-a*02:07基因的核酸序列如seqno.1所示：
(a)序列特征：
*长度：3517碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：基因组dna(gdna文库)
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人
(f)seqno.1核酸序列描述如下：
另一方面,本发明提供了上述检测试剂盒的应用,即对样本的hla-a*02:07基因进行分型。
例如,如本发明的实施例中所示,采用pcr-sso法进行hla-a*02:07基因的分型。
具体而言,本发明中对hla-a*02:07基因的分型的步骤如下:
抽提样本中的dna；
对hla的多态区域进行扩增；
在扩增过程中对pcr产物进行同位素或非同位素标记；
将pcr产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果；
其中,所述的探针针对pcr扩增产物设计并且固定在膜上；
所述的样本可以是rna、蛋白、细胞或者血清样本；
最常见的情况下,所述的样本是离体的外周血；
利用hla-a*02:07基因的分析结果可以判断cadrs。
本发明的实验数据证明,hla-a*02:07基因可作为预测克拉霉素所致cadrs的标记基因。
本发明的实验结果显示,克拉霉素所致cadrs患者中hla-a*02:07阳性比例相比于正常对照组及克拉霉素耐受组之间差异有统计学意义(如表3所示)；hla-a*02:07与克拉霉素结合模型如图1所示，其中，(a)克拉霉素在hla-a*02:07上的结合位置；(b)克拉霉素结合在hla-a*02:07hla-a的沟槽位置；(c)克拉霉素结合在hla-a*02:07hla-a和β2-微球蛋白的结合界面处。
本发明公开了一种人类白细胞抗原基因--hla-a*02:07基因,它与克拉霉素所致cadrs发病相关；hla-a*02:07基因可作为预测克拉霉素所致cadrs的标记基因；从患者的外周血中抽取dna后,用现行的方法检测hla-a*02:07基因,如pcr-sso(序列特异性寡核苷酸探针)方法；利用本发明提供的hla-a*02:07基因检测试剂盒可用于克拉霉素使用前筛查及筛选治疗克拉霉素所致cadrs的靶向药物；前者可指导临床用药,从而减少克拉霉素所致cadrs的发生；后者主要靶向作用于hla-a*02:07分子,从而阻断其在发病中与克拉霉素或其代谢产物之间的相互作用。
本发明的优点有:
1)可利用本发明所述的hla-a*02:07基因作为预测克拉霉素所致cadrs的标记基因。
2)利用本发明提供的hla-a*02:07基因可用于评价或制备克拉霉素使用前筛查试剂盒。
3)利用本发明提供的hla-a*02:07分子可用于评价或制备克拉霉素所致药疹靶向药物。
附图说明
图1.克拉霉素与hla-a*02:07分子结合模型图，
其中，(a)克拉霉素在hla-a*02:07上的结合位置；(b)克拉霉素结合在hla-a*02:07hla-a的沟槽位置；(c)克拉霉素结合在hla-a*02:07hla-a和β2-微球蛋白的结合界面处。
具体实施方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
基因的收集和抽提：
克拉霉素所致cadrs患者来自于中国上海复旦大学附属华山医院；
诊断标准由roujeau等人(roujeaujc.clinicalheterogeneityofdrughypersensitivity.toxicology2005；209:123-129.)提出，即临床表现有红斑、丘疹、风团样疹,伴或不伴有黏膜损害和肝肾功能损害等系统并发症，在知情同意的前提下参加本课题的研究，采集血液，并签署知情同意书；所有入组患者均通过病史及皮肤病理检查排除病毒疹及毒性红斑等其他诊断；所有患者均在发疹前2个月内首次口服克拉霉素；本实验设两组对照，其一是来自humanmhcdatabase(dbmhc)的283位健康人群，另外一组来自中国东部地区的34例患者为克拉霉素耐受组，均口服克拉霉素大于3月且没有发生任何药物反应，取样本血液300ul，按试剂盒说明书提取dna，用紫外分光光度仪检测dna浓度和纯度。
检测hla基因分型：本发明采用pcr-sso法(推荐
hla-a*02:07与克拉霉素所致cadrs相关：统计：利用spss16.0计算oddsratio(or)及其95％的可信区间，必要时使用haldane’s校正，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为p小于0.05；
结果显示：共搜集到克拉霉素所致cadrs患者11例，其中7例诊断为荨麻疹型，3例为多形红斑型，1例为发疹型(如表1所示)，克拉霉素耐受组34例，病例组和耐受组之间的年龄性别等一般特征无统计学差异(如表2所示)，克拉霉素所致cadrs患者中hla-a*02:07阳性比例相比于正常对照组及克拉霉素耐受组之间差异有统计学意义(如表3所示)；克拉霉素可能在hla-a*02:07上的结合位置见图1a，克拉霉素结合在hla-a*02:07hla-a的沟槽位置见图1b，克拉霉素结合在hla-a*02:07hla-a和β2-微球蛋白的结合界面处(如图1c所示)。
实验结果表明，本发明公开的人类白细胞抗原基因--hla-a*02:07基因与克拉霉素所致cadrs发病相关；所述的hla-a*02:07基因可作为预测克拉霉素所致cadrs的标记基因。
表1.克拉霉素所致cadrs患者的临床特点
表2.克拉霉素所致cadrs及耐受组患者临床资料
表3.hla-a*02:07单倍型频率在克拉霉素所致cadrs及对照组中的频率及关联分析
sequencelisting
<110>复旦大学，复旦大学附属华山医院
<120>一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及其用途
<130>20171026
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>3517
<212>dna
<213>hla-a*02:07
<400>1
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