本发明涉及一种乙型脑炎病毒抗血清及其制备方法，属于生物制品
技术领域：
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背景技术：
：流行性乙型脑炎是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病，对人类危害极大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，由于猪是乙型脑炎病毒传播的中间宿主，使猪成为该病的主要传染源，同时对猪引起严重的繁殖障碍，从而给养猪业和人类都带来了严重的威胁。乙型脑炎诊断技术、诊断试剂以及疫苗等是该病防制的关键。该病的诊断技术和疫苗质量监控都需要乙型脑炎阳性血清，但目前尚未报道高效的制备乙型脑炎高免血清的方法。本发明首次以乙型脑炎病毒活疫苗和灭活疫苗对spf鸡进行免疫，获得具有高中和效价的特异性阳性血清，并使得血清的纯净性更易控制和可靠，满足了乙型脑炎病毒活疫苗的外源病毒检验和鉴别检验。技术实现要素：本发明的目的：提供一种用于乙型脑炎活疫苗外源病毒检验和鉴别检验所需的具有高中和效价的特异性乙型脑炎病毒抗血清。本发明的技术方案1.本发明所述一种乙型脑炎病毒抗血清，其特征在于该乙型脑炎病毒抗血清是利用无特定病原体(spf)鸡制备而成，且该抗血清蚀斑减少中和效价高达1:1000倍以上，可用于乙型脑炎活疫苗的外源病毒检验和鉴别检验。2.本发明所述一种乙型脑炎病毒抗血清的制备方法，其特征在于：(1)制备动物：为spf鸡，不含有特定病原体；(2)免疫原：采用商品化的乙型脑炎灭活疫苗和乙型脑炎活疫苗作为免疫抗原；(3)高免血清的制备：spf鸡以乙型脑炎灭活疫苗和乙型脑炎活疫苗进行多次免疫制备而成，每次免疫前检测乙型脑炎抗体效价，最后一次免疫后一周血清中和抗体效价达到1：1000以上，心脏采血致死，分离血清。(4)高免血清的检验1)物理性状、无菌检验、支原体检验：均符合要求；2)效价测定：以蚀斑减少中和试验测定高免血清的中和效价≥1:1000；3)特异性检验：检测口蹄疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、猪圆环病毒病、伪狂犬病和牛病毒性腹泻/粘膜病抗体，均为阴性；4)外源病毒检验：无外源病毒污染。本发明具体实施方法1.乙型脑炎病毒抗血清的制备选取30-35日龄的spf鸡(本申请人单位自繁自养)，以sa14-14-2株乙型脑炎活疫苗(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)和p3株乙型脑炎灭活疫苗(购自辽宁成大生物股份有份公司)作为免疫抗原经肌肉注射进行轮流交替多次免疫。每次免疫后一周翅静脉采血1ml监测免疫后抗体水平的变化情况。当抗体水体达到1:1000以上时采用心脏采血法采集免疫鸡血，经3000r/min离心分离血清。-20℃冷冻保存，备用。2.乙型脑炎病毒抗血清的检验(1)无菌检验：按照中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)规定的方法进行无菌检验或纯粹检验，无菌生长。(2)支原体检验：按照《中国兽药典》规定的方法进行支原体检验，无支原体生长。(3)噬斑减少中和试验：采用噬斑减少中和试验监测免疫后的抗体水平，抗体水体应≥1:1000。本发明的积极意义本发明涉及一种乙型脑炎特异性阳性血清及其制备方法，旨在为乙型脑炎诊断技术、诊断试剂以及疫苗质量监控提供满足要求的乙型脑炎阳性血清。本发明所涉及的乙型脑炎阳性血清特异性高，且蚀斑减少中和效价高达1:1000倍以上，可满足乙型脑炎活疫苗的外源病毒检验和鉴别检验；另外，该发明中免疫动物为spf鸡，在试验动物的纯净度上容易控制，免疫原为商品化的乙型脑炎疫苗，避免使用乙型脑炎强毒免疫，无生物安全风险；简便易行，适合大规模制备。通过本发明发现spf鸡对乙型脑炎病毒具有较好的易感性，可为spf鸡作为研究乙型脑炎病毒的替代动物模型提供基础。实施例以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明请求保护的技术方案构成限制。实施例1——乙型脑炎病毒抗血清的制备1.试验动物：30-35日龄的spf鸡。2.免疫原：购自武汉科前动物生物制品有限责任公司的乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)和购自辽宁成大生物股份有份公司的乙型脑炎灭活疫苗(p3株)。3.免疫程序：选取30-35日龄的spf鸡，以乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)和乙型脑炎灭活疫苗(p3株)作为免疫抗原经肌肉注射进行多次免疫。每次免疫后一周翅静脉采血1ml监测免疫后抗体水平的变化情况。当抗体水体达到1：1000以上时采用心脏采血法取血，3000r/min离心分离血清。-20℃冷冻保存，备用。实施例2——乙型脑炎病毒抗血清的检验1.无菌检验：按照《中国兽药典》规定的方法进行无菌检验或纯粹检验，无菌生长。2.支原体检验：按照《中国兽药典》规定的方法进行支原体检验，无支原体生长。3.噬斑减少中和试验：采用噬斑减少中和试验监测免疫后的抗体水平，两次试验的检测结果见表1和表2。表1本发明制备的乙型脑炎病毒特异性血清抗体水平监测结果动物编号1-11-21-31-41-51-61-71-8首次免疫(第14日)00000000第二次免疫(第21日)100100100100100100100100第三次免疫(第28日)247179406126313681861326353第四次免疫(第35日)3380900670926004118320665661615第五次免疫(第42日)32823297179082263107911771366表2本发明制备乙型脑炎病毒特异性血清抗体水平监测结果动物编号2-12-22-32-42-52-62-7首次免疫(第14日)0000000第二次免疫(第21日)100100100100100100100第三次免疫(第28日)32677192479014671067509第四次免疫(第35日)3280233251922002161023202374第五次免疫(第42日)125023091616509102119682850两次试验结果表明，乙型脑炎病毒抗体在第四次免疫即第35日时达到峰值，适宜在此时间进行大量采血。4.特异性检验：检测口蹄疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、猪圆环病毒病、伪狂犬病和牛病毒性腹泻/粘膜病抗体，均为阴性；5.外源病毒检验：无外源病毒污染。实施例3——乙型脑炎病毒特异性血清用于乙型脑炎活疫苗鉴别检验和外源病毒检验1.猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)：每头份病毒含量105.2pfu。2.试验方法：按照《中国兽药典》《猪乙型脑炎活疫苗》质量标准(cvp3/2015/hym/042)，或者《中华人民共和国农业部公告第875号》猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)的质量标准进行鉴别检验和外源病毒检验。(1)鉴别检验：为确定该血清可用于猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)的鉴别检验，将猪乙型脑炎活疫苗稀释为2.0×102.0tcid50/0.1ml的疫苗稀释液，再与该血清以pbs(1/15mol/l，ph7.2)4倍稀释后溶液进行等量混合，37℃下中和90分钟后，接种细胞置37℃培养。同时设不中和疫苗的对照组，置同条件下培养。观察7日，判定结果。对照组细胞应出现特征性的细胞病变，中和组细胞应无细胞病变。两次试验结果表明，该血清可用于猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)的鉴别检验。(2)外源病毒检验为确定该血清可用于猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)的外源病毒检验，将1ml血清与1头份猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)(每头份病毒含量105.2pfu)混合后37℃下中和1小时，分别采用vero细胞、mdbk细胞和pk-15细胞传代培养。观察7日，判定结果。中和组细胞应无细胞病变。两次试验结果表明，1ml血清能完全中和1头份的猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)(每头份病毒含量105.2pfu)。(3)结论：本发明制备的乙型脑炎病毒特异性血清可用于猪乙型脑炎活疫苗(sa14-14-2株)的鉴别检验和外源病毒检验。当前第1页12