利用DNA条形码进行珍稀木材鉴定的方法与流程

本发明涉及一种利用dna条形码进行珍稀木材鉴定的方法。
背景技术：
：根据国家标准(gb/t18107--2000)规定，“红木”的范围确定为5属8类33种。5属是以树木学的属来命名的，即紫檀属、黄檀属、柿属、崖豆属及铁刀木属。8类则是以木材的商品名来命名的，即紫檀木类、花梨木类、香枝木类、黑酸枝类、红酸枝木类、乌木类、条纹乌木类和鸡翅木类。近几年红木收藏热不断水涨船高，根据海南省林业公安系统的不完整统计，每年珍稀木材的盗伐类案件发案在500起以上，并呈逐年上升趋势，许多案件的木材种类无法认定，而同一科属不同种的木材在价格上存在很大差异，涉案金额无法估计，导致诉讼、审理无法正常进行、无奈拖延甚至失败。由于名贵珍稀树种与普通树种价格上存在巨大差额，导致在古典家具、仿古木制品和乐器制造领域出现了大量的仿制品和假冒伪劣产品，而且一些禁止砍伐的珍稀树种也被乔装成普通木材进行运输和走私。为了维护人民的人身和财产安全，规范木材交易市场，保护生态环境，对木材进行科学、准确地鉴定识别具有重要的现实意义。传统的木材识别是一件实践性非常强的工作，该方法是建立在木材解剖学基础上，其方法可分为宏观识别、微观识别和辅助识别等方法。木材是由许多植物细胞组成的，准确识别木材的树种，应以微观识别特征为主要参考依据。宏观识别，是指在肉眼下或借助放大镜，依据所观察到的木材宏观构造特征来识别木材，一般只能识别出木材科属类别。微观识别，是指在显微镜下观察木材细胞组织的微观特征，据此微观特征来鉴定木材。辅助识别，是指通过眼、鼻、舌、手等感觉器官的作用，去观察研究木材的辅助特征来识别木材，如颜色、光泽、气味、滋味、纹理、结构、花纹、重量、硬度、树皮等。由于在分类学中近缘物种的木材结构非常相似，这给木材的物种准确鉴定带来一些困难，而且因为木材是树木的茎干部分，如果不结合根、叶、花与果实的识别，一般只能确定属，很难确定到种。此后，随着计算机技术的发展，又建立了基于计算机数据库的木材识别技术以及基于计算机数字图像处理技术的木材识别方法等。但这些方法主要依靠木材各项特征参数及图像数据的完整性，同时需要具有木材解剖学知识以及丰富实践经验的专业人员来鉴别，存在一定的局限性，并且这些鉴定方法的准确性也受到很多因素的制约。在刑侦工作中，亟需一种快速准确的木材鉴定方法，便于刑事技术人员操作，同时为案件侦查工作提供线索及有力的证据。利用dna分子检测手段针对木材进行检验鉴定，不仅可以准确识别木材的种类，而且应用于刑事案件也具有十分重要的意义。利用分子水平进行木材鉴定的报道目前尚不多见，原因在于木材dna提取较困难。我们通常所指的木材是植物的次生木质部，它包括边材、心材。木材不同部位dna含量明显不同，其中心材含量最低，且降解程度较严重，无法进行较长片段的扩增。对于已砍伐加工的木材进行dna提取相对较困难，特别是已加工的木材多数情况下树皮和边材部分已经失去，所利用的往往是心材部分，故所含的dna含量很少。由于木材种类不同，所含次生代谢干扰物质不同，所以能成功有效提取dna片段，也非易事。dna条形编码或称dna条形码技术(dnabarcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的dna片段(dnabarcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。在生命条形码概念提出之初，生物学家希望能找到一个基因或者一小段dna序列就可以区分地球上所有的物种，即onegeneforallspecies。在植物中，谱系偏选和杂交现象非常普遍，增加了筛选dna条形码的难度，这样就更需要从不同的基因组中选择基因来保证鉴定的准确度。在对植物的研究中，不少学者尝试从叶绿体基因组和核基因组中寻找理想的dna条形码，而在整个植物界，找到一个基因或不太长的一个dna片段来区别每一个物种几乎是不可能的，但是通过一个条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，逐级缩小范围，最后达到物种自动鉴定的目的是非常现实和可行的。综上所述，建立快速有效的珍稀木材鉴定方法尚需解决两个问题：(1)影响木材dna有效提取的因素有很多，随着木材离体时间的延长加工程度，dna处于一种不断降解的状态。木材经过高温干燥等处理后，dna降解也很严重。同时木材中所含有某些化合物及木材上附着的真菌、微生物都会干扰dna的提取质量。因此，首先要建立一套适用于木材dna提取的方法。(2)筛选适合作为珍稀木材鉴定的dna条形码序列。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用dna条形码进行珍稀木材鉴定的方法，尤其利用dna条形码进行降香黄檀鉴定的方法。本发明提供一种鉴定待测木材是否为降香黄檀的方法，包括如下步骤：以待测木材基因组dna为模板，分别采用特异引物组中的每个引物对进行如下步骤：依次进行pcr扩增、测序和序列比对；如果采用每个引物对进行上述步骤得到的同源性最高的序列中均含有降香黄檀来源的序列、待测木材为降香黄檀；所述特异引物对组为如下(b1)或(b2)或(b3)：(b1)由引物对ⅰ、引物对ⅱ、引物对ⅲ、引物对ⅳ和引物对ⅴ中的任意3个引物对组成；(b2)由引物对ⅰ、引物对ⅱ、引物对ⅲ、引物对ⅳ和引物对ⅴ中的任意4个引物对组成；(b3)由引物对ⅰ、引物对ⅱ、引物对ⅲ、引物对ⅳ和引物对ⅴ组成；(b1)或(b2)或(b3)中，所述引物对ⅰ由引物f1和引物r1组成；所述引物对ⅰ由引物f1和引物r1组成；所述引物f1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；所述引物r1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；(b1)或(b2)或(b3)中，所述引物对ⅱ由引物f2和引物r2组成；所述引物f2为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链dna分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；所述引物r2为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链dna分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子；(b1)或(b2)或(b3)中，所述引物对ⅲ由引物f3和引物r3组成；所述引物f3为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链dna分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子；所述引物r3为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链dna分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子；(b1)或(b2)或(b3)中，所述引物对ⅳ由引物f4和引物r4组成；所述引物f4为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列7所示的单链dna分子；(a12)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的dna分子；所述引物r4为如下(a13)或(a14)：(a13)序列表的序列8所示的单链dna分子；(a14)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的dna分子；(b1)或(b2)或(b3)中，所述引物对ⅴ由引物f5和引物r5组成；所述引物f5为如下(a15)或(a16)：(a15)序列表的序列9所示的单链dna分子；(a16)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的dna分子；所述引物r5为如下(a17)或(a18)：(a17)序列表的序列10所示的单链dna分子；(a18)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的dna分子。所述序列比对为在ncbi数据库中进行blast。所述木材基因组dna的提取方法包括如下步骤：采用含有2-巯基乙醇的裂解液对木材组织进行裂解；所述裂解的条件为：65℃裂解8小时。所述木材基因组dna可采用omega-hpplantdnakit商用试剂盒(omega，货号：d2485-01)参照所述木材基因组dna的提取方法提取得到。所述方法中，采用引物对ⅰ进行pcr扩增时的反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，运行39个循环；最后72℃延伸10min。采用引物对ⅱ进行pcr扩增时的反应程序为95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，运行29个循环；最后72℃延伸7min。采用引物对ⅲ进行pcr扩增的反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s，运行39个循环；最后72℃延伸7min。采用引物对ⅳ进行pcr扩增的反应程序为95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，运行33个循环；最后72℃延伸7min。采用引物对ⅴ进行pcr扩增的反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，运行25个循环；最后72℃延伸7min。本发明还保护一种木材基因组dna提取方法，包括如下步骤：采用含有2-巯基乙醇的裂解液对木材干粉进行裂解；所述裂解的条件为：65℃裂解8小时。本发明还保护所述木材基因组dna提取方法在木材鉴定中的应用。本发明还保护所述特异引物组。本发明还保护所述特异引物组在木材鉴定中的应用。所述木材可为降香黄檀。本发明还保护含有所述特异引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为鉴定木材。所述木材可为降香黄檀。本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本发明建立了一种木材基因组dna提取方法，该方法操作简单、产物质量较高，更适合木材类样本基因组dna的提取，基本可以满足后续实验对dna质量的要求；操作过程中所需的仪器和试剂都是实验室已有的，可以在不同dna实验室间推广；同时本发明通过对dna条形码序列的综合研判与分析，筛选出适用于降香黄檀的dna条形码，综合建立了一套降香黄檀鉴定方法。本发明可以应用于快速准确的鉴别降香黄檀，而且应用于刑事案件也具有十分重要的意义。附图说明图1为三种方法提取沉香叶片及心材基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1：十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取叶片基因组dna；泳道2：十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取心材基因组dna；泳道3：qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法提取叶片基因组dna；泳道4：qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法提取心材基因组dna；泳道5：步骤四建立的方法提取叶片基因组dna；泳道6：步骤四建立的方法提取心材基因组dna。图2为利用its2植物通用引物pcr扩增三种方法提取的降香黄檀叶片及心材基因组dna产物。泳道1-3：十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取叶片基因组dna的pcr扩增产物；泳道4-6：qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法提取叶片基因组dna的pcr扩增产物；泳道7-9：步骤四建立的方法提取叶片基因组dna的pcr扩增产物；泳道m：marker-2000bp；泳道10-12：十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取心材基因组dna的pcr扩增产物；泳道13-15：qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法提取心材基因组dna的pcr扩增产物；泳道16-18：步骤四建立的方法提取心材基因组dna的pcr扩增产物。图3为实施例3中rbcl片段测序结果比对。图4为实施例3中its2片段测序结果比对。图5为实施例3中psba-trnh片段测序结果比对。图6为实施例3中matk片段测序结果比对。图7为实施例3中rpoc1片段测序结果比对。图8为实施例4中rbcl片段测序结果比对。图9为实施例4中its2片段测序结果比对。图10为实施例4中psba-trnh片段测序结果比对。图11为实施例4中matk片段测序结果比对。图12为实施例4中rpoc1片段测序结果比对。图13为实施例4中ycf5片段测序结果比对。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。沉香：参考文献：董梦妤,焦立超,姜笑梅,等.沉香的资源分布、识别与贸易现状[j].木材工业,2016,30(4):20-24.；公众可以从公安部物证鉴定中心获得。降香黄檀：参考文献：邱治军,周光益,陈升华.海南特有珍贵红木树种——降香黄檀[j].林业实用技术,2004(6):105-107.；公众可以从公安部物证鉴定中心获得。白木香：参考文献：黄崇才.白木香aquilariasinensis(lour.)gilg种质形态学与细胞学研究[d].广州中医药大学,2009.；公众可以从公安部物证鉴定中心获得。实施例1、木材基因组dna提取方法建立和优化一、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法1、取待测样品，加2％不溶性pvp、液氮研磨至粉末状，转入2ml离心管。2、加入1.5ml洗涤溶液，充分混匀，4℃、10000r/min离心10min，弃上清。3、重复步骤2直至上清不再黏稠。4、加入65℃预热的ctab提取液，混匀，65℃水浴30min。5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温10000r/min离心10min。6、取上清液，重复步骤3(1～2次)。7、取上清液，加1/2体积的5mol/lnacl，加2/3体积的异丙醇，置－20℃冰箱2h，沉淀dna；4℃、10000r/min离心10min。8、弃上清，用70％乙醇溶液洗沉淀2次，风干，用50μlte溶解。9、加入无dnase的rnase至终浓度为10μg/μl，37℃保温30min，－20℃保存备用。二、qiagendneasyplantminikit商用试剂盒1、研磨待测样本。2、加400μlbufferap1和4μlrnasea，涡旋震荡，65℃孵育10min，期间颠倒混匀2到3次。3、加130μlbufferp3，混匀，冰浴5min。4、将溶解产物移至qiashredder离心管置于2ml收集管，14000rpm离心2分钟。5、转移液体至杂质干扰的新离心管，加入1.5倍体积的aw1，混匀。6、取650μl混合物至dneasymini离心柱的放到2ml收集管中，8000rpm离心1min，弃流动相，用剩余样品重复此步骤。7、将离心柱置于新的2ml收集管中，加500μl的bufferaw2，8000rpm离心1min。弃液体。8、加500μl的bufferaw2，14000rpm离心2min。9、将离心柱置于新的1.5ml或2ml离心管中。10、加100μlbufferae溶解，室温孵育5min，8000rpm离心1min。11、重复步骤10。上述步骤中的bufferap1、rnasea、bufferp3、qiashredder离心管、aw1、dneasymini离心柱、bufferaw2和bufferae均来自于qiagendneasyplantminikit商用试剂盒(qiagen，货号：qiagen-69104)。三、omega-hpplantdnakit商用试剂盒1、取10-50mg粉末状木材干组织加入至溶液a(600μlbuffercpl)中，涡旋震荡充分混匀，保证所有粉末溶解。2、65℃孵育30min。3、加入600μl溶液b(24体积份氯仿+1体积份异戊醇)，高速震荡混匀20s，10000×g室温离心10min。4、取上清液转移至新的1.5ml离心管中。5、加入10μlrnasea，室温孵育10-20分钟。6、加入溶液c(150μlbuffercxd+300μl分析纯乙醇)，涡旋震荡混合，得到混合物。7、将混合物加至hibinddna柱中(hibinddna柱置于2.0ml收集管中)，10000×g室温离心1min，弃掉收集管中及其中的液体。8、将hibinddna柱基于新的2.0ml收集管中，加入650μlspwwashbuffer(已添加无水乙醇)，10000×g室温离心1min，弃掉收集管中的液体。9、重复步骤8。10、10000×g室温离心2min，充分去除hibinddna柱中的乙醇，弃掉收集管中的液体。11、将hibinddna柱置于新的1.5ml离心管中，加入50-100μlelutionbuffer(提前预热至65℃)，室温孵育3min。10000×g室温离心1min，收集离心管中的dna。上述步骤中的buffercpl、rnasea、buffercxd、hibinddna柱、spwwashbuffer和elutionbuffer均来自于omega-hpplantdnakit商用试剂盒(omega，货号：d2485-01)。四、改良木材基因组dna提取方法使用现有的omega-hpplantdnakit商用试剂盒(omega，货号：d2485-01)，针对木材的特殊性，进行dna提取条件的优化，在裂解过程中加入2-巯基乙醇，同时延长了裂解时间，实际操作中裂解8h。优化的木材dna提取依次按照如下步骤操作：1、取10-50mg粉末状木材干组织加入至溶液a(600μlbuffercpl+10μl2-巯基乙醇)中，涡旋震荡充分混匀，保证所有粉末溶解。2、65℃孵育8h。3、加入600μl溶液b(24体积份氯仿+1体积份异戊醇)，高速震荡混匀20s，10000×g室温离心10min。4、取上清液转移至新的1.5ml离心管中。5、加入10μlrnasea，室温孵育10-20分钟。6、加入溶液c(150μlbuffercxd+300μl分析纯乙醇)，涡旋震荡混合，得到混合物。7、将混合物加至hibinddna柱中(hibinddna柱置于2.0ml收集管中)，10000×g室温离心1min，弃掉收集管及其中的液体。8、将hibinddna柱置于新的2.0ml收集管中，加入650μlspwwashbuffer(已添加无水乙醇)，10000×g室温离心1min，弃掉收集管中的液体。9、重复步骤8。10、10000×g室温离心2min，充分去除hibinddna柱中的乙醇，弃掉收集管中的液体。11、将hibinddna柱置于新的1.5ml离心管中，加入50-100μlelutionbuffer(提前预热至65℃)，室温孵育3min。10000×g室温离心1min，收集离心管中的dna。上述步骤中的buffercpl、rnasea、buffercxd、hibinddna柱、spwwashbuffer和elutionbuffer均来自于omega-hpplantdnakit商用试剂盒(omega，货号：d2485-01)。五、方法效果比较1、分别采用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法、qiagendneasyplantminikit商用试剂盒和步骤四建立的方法提取降香黄檀的叶片基因组dna和心材基因组dna进行提取(叶片和心材至少100mg，用研钵研磨成干粉)。2、将步骤1提取的叶片基因组dna和心材基因组dna进行琼脂糖凝胶电泳。3、检测步骤2得到的叶片基因组dna和心材基因组dna浓度。4、利用its2引物(引物i2f和引物i2r)和对步骤1提取的叶片基因组dna和心材基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1、表1和图2所示。表1不同方法提取基因组dna的浓度上述结果表明，步骤一建立的方法相对于ctab法提取的木材心材基因组dna的浓度提高了约5倍，比qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法提取植物基因组dna的浓度提高了3倍。综合分析，传统的ctab法虽成本低廉，但操作复杂、耗时长；qiagendneasyplantminikit商用试剂盒虽操作简单，时间短，但成本较高；同时，这两种方法所提取木材心材的dna样本，不能满足下游生物学实验的需要；相比，步骤一建立的方法成本低、操作简单，裂解充分，所提取的木材dna样本，更能满足后续实验的需要。实施例2、用于珍稀木材鉴定的dna条形码筛选及引物制备针对珍稀木材鉴定的需要，通过序列分析和dna条形码功能分析，筛选出6种用于木材鉴定的dna条形码，分别为its2、rbcl、matk、psba-trnh、rpoc1和ycf5。其中，its2、rbcl、matk、psba-trnh和rpoc1适用于降香黄檀的鉴定；its2、rbcl、matk、psba-trnh、rpoc1和ycf5适用于白木香的鉴定。针对上述6种dna条形码设计引物，得到引物组合，引物组合由如下a)-f)所示的引物对组成：a)用于检测its2的引物对(扩增产物226bp)：i2f(序列表的序列1)：5'-atgcgatacttggtgtgaat-3'；i2r(序列表的序列2)：5'-gacgcttctccagactacaat-3'；b)用于检测psba-trnh的引物对(扩增产物401bp)：psba-trnhf(序列表的序列3)：5'-gttatgcatgaacgtaatgctc-3'；psba-trnhr(序列表的序列4)：5'-cgcgcatggtggattcacaatcc-3'；c)用于检测rpoc1的引物对(扩增产物494bp)：rpoc1f(序列表的序列5)：5'-ggcaaagagggaagatttcg-3'；rpoc1r(序列表的序列6)：5'-ccataagcatatcttgagttgg-3'；d)用于检测rbcl的引物对(扩增产物704bp)：rbclf(序列表的序列7)：5'-atgtcaccacaaacagaaac-3'；rbclr(序列表的序列8)：5'-tcgcatgtacctgcagtagc-3'；e)用于检测matk的引物对(扩增产物794bp)：matkf(序列表的序列9)：5'-cgatctattcattcaatatttc-3'；matkr(序列表的序列10)：5'-tctagcacacgaaagtcgaagt-3'；f)用于检测ycf5的引物对(扩增产物376bp)：ycf5f(序列表的序列11)：5'-actttagagcatatattaactc-3'；ycf5r(序列表的序列12)：5'-actttagagcatatattaactc-3'；实施例3、降香黄檀鉴定方法建立及验证一、降香黄檀鉴定方法建立1、按照实施例1步骤四的方法提取待测木材的基因组dna。2、以步骤1得到的基因组dna为模板，分别采用三种以上实施例2制备的a)-e)所示的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物。pcr反应体系：pcrmastermix25μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，模板dna1-20μl，ddh2o补至50μl。用a)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，运行39个循环；最后72℃延伸10min。用b)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，运行29个循环；最后72℃延伸7min。用c)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s，运行39个循环；最后72℃延伸7min。用d)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，运行33个循环；最后72℃延伸7min。用e)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，运行25个循环；最后72℃延伸7min。3、将步骤2得到的扩增产物进行双向测序。4、将步骤3得到的正向测序序列和反向测序序列拼接后，将测序结果在ncbi官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对法(blast)进行比对，如果同源性最高的序列中均含有降香黄檀来源的序列、待测木材为降香黄檀。二、方法验证1、采用步骤一的方法对3个降香黄檀叶片样本和10个降香黄檀木材样本进行鉴定。2、采用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法替代实施例1步骤四的方法，按照步骤一的方法对3个降香黄檀叶片样本和6个降香黄檀木材样本进行鉴定。3、采用qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法替代实施例1步骤四的方法，按照步骤一的方法对3个降香黄檀叶片样本和6个降香黄檀木材样本进行鉴定。4、采用omega-hpplantdnakit商用试剂盒法替代实施例1步骤四的方法，按照步骤一的方法对3个降香黄檀叶片样本和6个降香黄檀木材样本进行鉴定。所有叶片样本可以得到测序序列，对木材样本的测序效率进行统计(每个木材测序样品应该应获得2个序列，包括一个正向序列和一个反向序列；测序效率为获得序列数/应得序列数×100％)，结果如表2-表6所示。表2木材样本its2片段测序结果比较表3木材样本psba-trnh片段测序结果比较表4木材样本rpoc1片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法6541.66％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6758.33％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6758.33％实施例1步骤四的方法101470.00％表5木材样本rbcl片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法600％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6325.00％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6433.33％实施例1步骤四的方法10630.00％表6木材样本matk片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法600qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6216.67％omega-hpplantdnakit商用试剂盒600实施例1步骤四的方法10210.00％测序效率统计结果表明，采用实施例1步骤四的方法提取得到的基因组dna，测序效率较高，大于700bprbcl和matk扩增片段电泳显示，扩增成功率较低。扩增片段小于500bp的its2、psba-trnh、rpoc1的扩增成功率明显高于rbcl和matk，测序成功率基本都可以达到60％以上，尤其是应用its2基本都可以获得可供后续测序及加工比对的序列。5、将上述测序结果在ncbi官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对法(blast)进行比对。其中一个样本的测序结果如序列13-17所示(序列13：its2片段测序结果，序列14：psba-trnh片段测序结果，序列15：matk片段测序结果，序列16：rbcl片段测序结果，序列17：rpoc1片段测序结果)，比对如图3-图7所示。结果表明，采用任意三种以上dna条形码的组合可以确定待测木材是否为降香黄檀。其余样本均可以采用任意三种以上dna条形码的组合进行区分。上述结果表明，如果就单一条形码的结果进行比对，出现同科属植物甚至不同科属植物均能100％匹配的情况，不能准确获得待测样品的鉴定结果；将上述条形码都进行比对或其中的三个以上进行比对后，可以确定待测样品是否为降香黄檀。实施例4、白木香鉴定方法建立及验证一、白木香鉴定方法建立1、按照实施例1步骤四的方法提取待测样品的基因组dna。2、以步骤1得到的基因组dna为模板，分别采用三种以上实施例2制备的a)-f)所示的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物。pcr反应体系：pcrmastermix25μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，模板dna1-20μl，ddh2o补至50μl。用a)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，运行39个循环；最后72℃延伸10min。用b)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，运行29个循环；最后72℃延伸7min。用c)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s，运行39个循环；最后72℃延伸7min。用d)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，运行33个循环；最后72℃延伸7min。用e)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，运行25个循环；最后72℃延伸7min。用f)所示引物对进行pcr扩增的反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s，运行39个循环；最后72℃延伸7min。3、将步骤2得到的扩增产物进行双向测序。4、将步骤3得到的正向测序序列和反向测序序列拼接后，将测序结果在ncbi官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对法(blast)进行比对，如果同源性最高的序列中均含有白木香来源的序列、待测木材为白木香。二、方法验证1、采用步骤一的方法对3个白木香叶片样本和10个白木香木材样本进行鉴定。2、采用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法替代实施例1步骤四的方法，按照步骤一的方法对3个白木香叶片样本和6个白木香木材样本进行鉴定。3、采用qiagendneasyplantminikit商用试剂盒法替代实施例1步骤四的方法，按照步骤一的方法对3个白木香叶片样本和6个白木香木材样本进行鉴定。4、采用omega-hpplantdnakit商用试剂盒法替代实施例1步骤四的方法，按照步骤一的方法对3个白木香叶片样本和6个白木香木材样本进行鉴定。所有叶片样本可以得到测序序列，对木材样本的测序效率进行统计(每个木材测序样品应该应获得2个序列，包括一个正向序列和一个反向序列；测序效率为获得序列数/应得序列数×100％)，结果如表7-表12所示。表7木材样本its2片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法6758.33％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6866.67％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6866.67％实施例1步骤四的方法101890.00％表8木材样本psba-trnh片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法6541.67％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6758.33％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6866.67％实施例1步骤四的方法101680.00％表9木材样本ycf5片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法6541.67％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6758.33％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6758.33％实施例1步骤四的方法101680.00％表10木材样本rpoc1片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法6650.00％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6866.67％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6758.33％实施例1步骤四的方法101365.00％表11木材样本rbcl片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法618.33％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒6325.00％omega-hpplantdnakit商用试剂盒6325.00％实施例1步骤四的方法10735.00％表12木材样本matk片段测序结果比较dna提取方法测序样品数获得序列数测序效率十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法600％qiagendneasyplantminikit商用试剂盒600％omega-hpplantdnakit商用试剂盒600％实施例1步骤四的方法1000％测序效率统计结果表明，采用实施例1步骤四的方法提取得到的基因组dna，测序效率较高，大于700bprbcl和matk扩增片段电泳显示，扩增成功率较低。扩增片段小于500bp的its2、psba-trnh、rpoc1、ycf5的扩增成功率明显高于rbcl和matk，测序成功率基本都可以达到60％以上，尤其是应用its2基本都可以获得可供后续测序及加工比对的序列。5、将上述测序结果在ncbi官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对法(blast)进行比对。其中一个样本的测序结果如序列18-24所示(序列18：its2片段测序结果，序列19：psba-trnh片段测序结果，序列20：matk片段测序结果，序列21：rbcl片段测序结果，序列22：rpoc1片段测序结果，序列23：ycf5片段测序结果)，比对结果如图8-图13所示，结果表明，采用任意三种以上dna条形码的组合可以确定待测木材是否为白木香。其余样本均可以采用任意三种以上dna条形码的组合进行区分。结果表明，如果就单一条形码的结果进行比对，出现同科属植物甚至不同科属植物均能100％匹配的情况，不能准确获得待测样品的鉴定结果；将上述条形码都进行比对或其中的三个以上进行比对后，可以确定待测样品是否为白木香。<110>公安部物证鉴定中心<120>利用dna条形码进行珍稀木材鉴定的方法<160>23<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgcgatacttggtgtgaat20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2gacgcttctccagactacaat21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3gttatgcatgaacgtaatgctc22<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4cgcgcatggtggattcacaatcc23<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5ggcaaagagggaagatttcg20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6ccataagcatatcttgagttgg22<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7atgtcaccacaaacagaaac20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8tcgcatgtacctgcagtagc20<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9cgatctattcattcaatatttc22<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10tctagcacacgaaagtcgaagt22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11actttagagcatatattaactc22<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>12actttagagcatatattaactc22<210>13<211>216<212>dna<213>降香黄檀<400>13ccaatcgccgccccaacccctgtgcctccggccacggagcggggcgaatgctggcctccc60gtgagcaccgcctcgcggctggctgaaaatcgggttcgtggtggatgcagcgccatgaca120gacggtggttgagcgtgttctcgaggccagtcatgagggcggcctccaccagctccgtac180ccagcgacccgcgagcgatgtcgatcgcccacgacg216<210>14<211>355<212>dna<213>降香黄檀<400>14ataacttccctctagacctagcttcggtcgaggctccatctctaaatggataagattttt60gtcttaaaggatacgggtttttgaaagtaaaggagcaatatcaacagagtttctattgct120cctttacttttttttttgacattgcaaagaaagtcatatgtttaaaaaaaaagaacaaat180gaatgcttccattcttttgctttttgtatcccatcctatcttatcttagaaaacgagtaa240aaactaaagttagagaagaaacataaaaataataacaaaagaaaagagtataaatggtat300ggtttagtctaggatatttttattaagggcggatgtaccaagggatcaagggagt355<210>15<211>769<212>dna<213>降香黄檀<400>15ccccccttctttcatttattaagattgtttatttatgagtattgtaattggaatagtctt60attactaaaaaaaaacttatttctactttttcaaaaagtaatccaagaattctcttgttc120ctatataatttttatgtatatgaacacgaatccatcttcctttttctacgtaagagatcc180tcttatttacgattaaactcttttatcgttatttttgagcgaatctatttctatgcaaaa240atcgaacatcttgtggaagtcttttctaagaatttttcgtctaccttatcattcttcaag300gatcctttgattcattatgttagatatcaaggaaaagccattctggcttcaaagaatgcg360cctcttttgatgaataaatggaaacactatctcatctatttctggcaatgtcatttttat420gtttggtctcaacctggaacgatccatataaatccattattatccgagaattcatttcac480tttttttgggggggctatctttcaaatgtgcggctcaatttttcagtggtccggaatcaa540atgctagaaaagtcatttctaatcgaaattcttgtgaaaaaacttgatacaatagttcca600attattcctttaattagatctttggctaaagcgaaattttgtaatatattagggcatccc660attagtaagcctgtttgggccgattcatccgattttgatattattaaccgatttttgcgg720atatgcagaaatttttctcattattataatggatcctcaaaaaaaaaaa769<210>16<211>607<212>dna<213>降香黄檀<400>16aagtgttgggttcaaagctggtgttaaagattataaattgaattattatactcctgacta60tgaaacgaaagatactgatatcttggccgcattccgagtaactcctcaacctggagttcc120tcctgaagaagcgggtgccgcggtagctgccgaatcttctactggtacatggacaaccgt180ttggaccgatgggcttaccagtcttgatcgttacaaaggacgatgctacaacatcgagcc240cgttgctggagaagaaaatcaatatattgcttatgtagcttatcccttagacctttttga300agaaggttctgttactaacatgtttacttccattgtaggtaatgtatttgggttcaaggc360cctgcgcgccctacgtctggaagatttgcgaatccctacttcttatattaaaactttcca420aggtccgcctcacggtatccaagttgaaagagataaattaaacaagtatggccgtcccct480attgggatgtactattaaaccgaaattggggttatccgctaagaattacggtcgagcagt540ttatgaatgtctccgcggtggacttgattttaccaaagatgatgaaaatgtgaattccca600accattt607<210>17<211>487<212>dna<213>降香黄檀<400>17agagactctgcttggcaaacgggttgattattcgggacgttctgttattgtagtaggtcc60atcactttcattacatcgatgtggattacctcgcgaaatagcaatagagcttttccagac120atttgtaattcgtggtctaattcgaaaacattttgcttcgaacatgggaattgctaagag180taaaattagggaaaaagaaccgattgtatgggaactacttcaagaagttatgcaggggca240tcccgtattgctaaatagagcgcctactctgcatagattaggtatacaggcattccaacc300cattttagtagaagggcgtgctatttgtttacatccattagtttgtaaaggattcaatgc360agactttgatggagaccaaatggctgttcatgtgcctttatctttggaagctcaaacgga420agctcgtttacttatgttttctcatatgaacctcttgtctccgtcgatgggggatcccat480ttctgta487<210>18<211>230<212>dna<213>白木香<400>18cgcattgtagccccccaccctcgtcgtaatgtctgtgagggctgtgtggggctgatactg60gccttcccgtaggcacagcaatgcggttggcccaaatggaggaacccagggcggtgtatg120ccatgatgaacggtggtgtgtgcttagcctgccgtcgttagagcatcatgcgcatcatgc180ccttgaggtatgtttcgtggacaaccccggtgcaatcatagcgcgcatcg230<210>19<211>441<212>dna<213>白木香<400>19gttatgcatgaacgtaatgctcataacttccccctagacctagctgctattgaagctcca60tctacaaatggataagacttttgtcttagtgtatatgattttttgaaaggaaaaaaagta120aaggggcaataaccaatttcttgttttaccattcccaagaggattggtattgctccttta180tttcttttagtagtcttttatttacttaggtttttttctttaccttaactcaactttact240ataacaaaataggaaaaggtggtcttaatgagtttggtttagtatcataccttaaattag300tccttaccaatcttttgtgaagttcttattttcttttactgttttaaatgaaagtgaaaa360aatagactaatattcataaaagtggaggggcggatgtagccaagtggattaaggcagtgg420attgtgaatccaccatgcgcg441<210>20<211>805<212>dna<213>白木香<400>20tacctcaccccatccattttgaaatcttggttcaagcctttcgctgctggttaaaagatg60cctcttttttgcatttattacggttttttttctacgagtatttgaatttgaagagtctta120ttacttcaaagaaatccatttctattttgaatttgaatccaagattcttttttttcctat180ataattctcatatatgtgagtgcgaattaattttcctttttctccgtaaccaatcctatc240atttacgatcaacatcttctgcaatctttcttgaacggatctatttctatggaaaaatcg300aacatcttgtagaagttttttctaatgattttcagaacaacctatccttgttcaaggatc360ccttcatacattttgttagatatcaaggaaaatctattcttgcttcaaacgatacgcctc420ttatgatgaataagtggaaatattactttatcaatttctggcaatatcatttttatgtgt480ggtctcaatcaggaggggtccgtataaaccaattatgcaaatattctcttgactttctag540gctatctttcaaatgtgcgattaaatccttcagtggtacgcagtcaaatgctagaaaact600tctttctaatagataatactattaaaaagctagatacaaaaatgccaatgatttctctga660ttggatcattgtctaaagcgaatttttgtaacgcatcgtgtcatcctattagtaagccaa720cttgggtcgattcatcagattctgatattatcgaccgatttttgcgtatatgcagaaatt780tttctcattatcacagcggatcctc805<210>21<211>703<212>dna<213>白木香<400>21taaagcaagtgttggattcaaagctggtgttaaagagtataaattgacttattatactcc60tgaatatgaaaccaaagatactgatatcttggcagcattccgagtaactcctcaacctgg120agttccgcctgaggaagcaggggctgcggtagctgctgaatcttctactggtacatggac180aactgtgtggaccgacgggcttaccagccttgatcgttacaaagggcgatgctaccacat240cgagcccgttgctggggaagaaaatcaatatatatgttatgtagcttaccccttagacct300ttttgaagagggttctgttactaacatgtttacttccattgttggtaatgtatttgggtt360caaagccctgcgcgctctacgtctagaagatctgcgaatccctacttcttatattaaaac420tttccaaggtccgcctcatggcatccaagttgaaagagataaattgaacaagtacggccg480tcccctattgggatgtactattaaacctaaattggggttatccgctaaaaactacggtag540agcggtttatgaatgtctacgtggtggacttgattttaccaaagatgatgagaatgtgaa600ctcccaaccatttatgcgttggagagaccgtttcttattttgtgccgaagcaatttataa660agcacaggctgaaacaggtgaaatcaaagggcattacttgaat703<210>22<211>529<212>dna<213>白木香<400>22ggcaaagagggaagatttcgcgagactctgcttggcaaacgcgttgattattcggggcgt60tctgtcattgttgttggcccctcactttcattacatcgctgtgggttgcctcgcgaaatg120gcaatagagcttttccagacatttgtaattcgtggtctaattagacaacatcttgcttcg180aacataggagttgctaagagtcaaattcgcgaaaaggggccaattgtatggcaaatactt240caagaagttatgcaggggcatcctgtattgctgaatagagcgcctactctgcatagatta300gggatacaggcattccaacccattttagtggaagggcgtgctatttgtttacacccatta360gtttgtaagggatttaatgcagactttgatggggatcaaatggctgttcatgtaccttta420tctttagaggctcaagcggaggttcgtttacttatgttttctcatatgaatctcttgtct480ccagctattggggatcctatttccgtaccaactcaagatatgcttatgg529<210>23<211>382<212>dna<213>白木香<400>23attaactcatatatccttttcggtcgtttcaattgtaattacaattcattttttaacttt60attagtcgatgaagttgtaggactatatgattcatcagaaaggggtatgatagctaccct120tttctgtataacaggattattagtcactcgttggatttattcggggaattttcctttaag180taatttatatgaatcattaatctttctttcatggagtttctccgttattcatatggtttc240ctattttcattttaaaaagcataaaaatgctttaagtgcaataaccgcatcaagtgctat300ttttacccaaggctttgttacttcgggtcttttaaccaaaatgcatcaatccgcactatt360agtacctgctctccaatcccag382当前第1页12