本发明属于生物制药领域，涉及一种通过微生物发酵生产抗生素的生产工艺。具体地说，本发明涉及一种发酵生产麦白霉素的方法。
背景技术
麦白霉素(meleumycin，mlm)是我国抗生素工作者相继从四川、广东土壤中分离出的链霉菌(s.mycarofaciens10204及s.mycarofaciens1748)，经发酵提炼所得。麦白霉素对金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌和肺炎球菌中的红霉素敏感菌有较好的抗菌作用，对细小的链球菌和淋病奈瑟氏球菌等其它常见临床致病菌有一定的抗菌活性。
2005版药典对麦迪霉素的要求是含麦迪霉素a1不得低于35.0％。随着药典的改版，对麦白霉素的要求进一步提高。2010年版药典二部规定麦白霉素中麦迪霉素a1应不低于48％，吉他霉素a6应不低于12％，麦迪霉素a1、a2、a4、吉他霉素a6、a8之和应不低于70％。然而在科研和实际生产中，有的麦白霉素产生菌发酵所产生的麦迪霉素a1和吉他霉素a6所占比例偏低，使最终成品质量刚好在合格线边沿，不合格的风险较大。同时，因为麦白霉素生产水平一直较低，生产成本高，被其它大环类脂内替代的可能非常大。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题就是提供一种麦白霉素的发酵生产工艺，通过该工艺能使麦白霉素的效价提高20％以上，关键组分麦迪霉素a1比例和吉他霉素a6比例提升，降低生产成本。
本发明技术方案如下：
一种发酵生产麦白霉素的方法，包括：在麦白霉素发酵过程中，向发酵前期的发酵液中接入包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液。
进一步地，所述发酵前期为从发酵初始至发酵周期1/5(五分之一)的时间段，优选为发酵初始。
进一步地，所述包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液的发酵液状态为发酵液中麦白霉素效价大于等于2500μ/ml时间段；优选发酵液中麦白霉素效价大于等于2700μ/ml时间段；进一步优选发酵液中麦白霉素效价为2780-2850μ/ml时间段。
进一步地，一次性或分多次接入包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液；优选一次性接入。
进一步地，所述包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液的添加量为1-5％，优选2-3％。
进一步地，所述包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液为发酵后期产生。
根据本发明，所述的发酵生产麦白霉素的发酵培养基的成分和含量与现在常规的发酵生产麦白霉素的发酵培养基相同；换言之，本发明是在现有培养基和现有接种种子条件的基础上，仅加入了一些发酵后期包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液。
进一步地，本发明方法发酵过程中，罐压为0.02-0.03mpa，发酵温度为26±2℃，发酵周期为56±10h。
在发明一个具体实施方式中，在发酵初始时接入(发酵后期产生的)所述包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液，添加量为3％，该发酵液中麦白霉素效价为2850μ/ml，麦迪霉素a1所占比例为39.1％，吉他霉素a6所占比例为18.2％。
在发明另一个具体实施方式中，在发酵10h时接入(发酵后期产生的)所述包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液，添加量为3％，该发酵液中麦白霉素效价为2786μ/ml，麦迪霉素a1所占比例为38.2％，吉他霉素a6所占比例为19.3％。
在发明另一个具体实施方式中，在发酵初始时接入(发酵后期产生的)所述包含麦白霉素次级代谢产物的发酵液，添加量为1％，该发酵液中麦白霉素效价为2836μ/ml，麦迪霉素a1所占比例为37.2％，吉他霉素a6所占比例为19.7％。
本发明中，若无特殊指明，所述发酵液的添加量是指移入所述发酵液和接种后培养液(发酵液)体积的比例。所述接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。
进一步地，本发明方法所用菌株为生米卡链霉菌(streptomycesmycarofaciens)。
本发明所述微生物均为已知微生物，均可市售购得。
具体地，本发明上述发酵生产麦白霉素的方法包括以下步骤：
1)将生米卡链霉菌在种子罐培养基中培养至对数生长期后转入发酵罐培养基中培养；
2)在步骤1)中所述发酵罐培养的发酵初始至发酵周期1/5时间段内，向发酵液中一次性或分多次接入处于发酵后期的所述含有麦白霉素次级代谢产物的发酵液，添加量为1-5％，所述发酵液中麦白霉素效价为大于等于2500μ/ml时间段；正常培养至发酵结束；发酵过程中，罐压为0.02-0.03mpa，发酵温度为26±2℃，发酵周期为56±10h。
本发明尝试在发酵过程中添加发酵后期的发酵液的最初目的是利用麦白霉素发酵液中产生的带活性的麦白霉素对球菌的抑制作用，解决生产过程中可能出现的染球菌问题。但发酵调控学认知认为，抗生素的晚合成原因之一，可能是避免生长受其自身产物的抑制。因在生长期大多数微生物对其自身产生的抗生素敏感，只有在生产期才在生理上获得耐药性。为了考察麦白霉素次级代谢产物会不会对发酵过程本身产生抑制作用，本发明在未染菌的实验罐中尝试添加。结果惊喜地发现，添加后期发酵液后不但对发酵过程没有抑制作用，并且还促进了麦白霉素中麦迪霉素a1和吉他霉素a6的合成，使麦白霉素效价大幅提升。虽然目前作用机制还不明确，但初步判定麦白霉素的次级代谢产物可能充当了诱导剂的作用。
本发明方法操作简单易行，可以显著降低生产成本；其推广应用对提高麦白霉素的生产水平有较大的益处。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
若无特殊指明，本发明所述麦白霉素效价、麦迪霉素a1所占比例、吉他霉素a6所占比例均可采用本领域常规方法例如中国药典规定的高效液相色谱法检测。
实施例1
在接罐作业安排上，先计算好种子罐转入发酵罐的时间应与前期其它发酵罐达到2500μ/ml以上时间接近。
先将菌种接入一级种子罐培养基，种子罐培养基通常含有葡萄糖，淀粉，黄豆粉，磷酸二氢钾，硫酸铵，碳酸钙等，在罐压0.05mpa，28℃培养30h后转入二级种子罐培养基，二级种子罐培养基与一级种子罐培养基配方相同。在罐压0.05mpa，28℃培养10h后将相同量的二级种子液同时转入两个发酵罐培养基，二级种子液转种量为10％。发酵罐培养基通常含有：油，葡萄糖，淀粉，黄豆粉，酵母粉，鱼粉，磷酸二氢钾，硫酸镁，碳酸钙等。其中发酵罐a为对照组，转入二级种子后按正常工艺条件培养；发酵罐b为实验组，转入二级种子后同时将其它发酵罐的后期发酵液(效价为2850μ/ml，麦迪霉素a1所占比例为39.1％，吉他霉素a6所占比例为18.2％)转入发酵罐同步培养，后期发酵液添加量为3％，转入后培养条件与发酵罐a相同，两个罐均在罐压0.02-0.03mpa，26℃培养56h放罐。用紫外-可见分光光度计法测定麦白霉素效价，高效液相色谱法检测麦白霉素的组分。经测定对照组发酵罐a的效价为2786μ/ml，麦迪霉素a1比为38.2％，吉他霉素a6比为19.3％；实验组发酵罐b的效价为3716μ/ml，麦迪霉素a1比为43.2％，吉他霉素a6比为23.3％。实验组比对照组效价提高25.0％，麦迪霉素a1所占比例提高11.5％，吉他霉素a6所占比例提高17.1％。
实施例2
先将菌种接入一级种子罐培养基，在罐压0.05mpa，28±2℃培养30h后转入二级种子罐培养基。在罐压0.05mpa，28±2℃培养10h后将相同量的二级种子液同时转入两个发酵罐培养基，二级种子液转种量为10％。其中发酵罐c为对照组，转入二级种子后按正常工艺条件培养；发酵罐d为实验组，转入二级种子后按正常工艺条件培养，培养至10h将其它发酵罐的后期发酵液(效价为2786μ/ml，麦迪霉素a1所占比例为38.2％，吉他霉素a6所占比例为19.3％)转入发酵罐同步培养，后期发酵液添加量为3％，转入后继续按正常工艺条件培养，两个罐均在罐压0.02-0.03mpa，26±2℃培养56h放罐。经测定对照组发酵罐c的效价为2836μ/ml，麦迪霉素a1比为37.2％，吉他霉素a6比为19.7％；实验组发酵罐d的效价为3616μ/ml，麦迪霉素a1比为42.2％，吉他霉素a6比为22.9％。实验组比对照组效价提高21.5％，麦迪霉素a1所占比例提高11.8％，吉他霉素a6所占比例提高13.9％。其他操作基本同实施例1。
实施例3
先将菌种接入一级种子罐培养基，在罐压0.05mpa，28±2℃培养30h后转入二级种子罐培养基。在罐压0.05mpa，28±2℃培养10h后将相同量的二级种子液同时转入两个发酵罐培养基，二级种子液转种量为10％。其中发酵罐e为对照组，转入二级种子后按正常工艺条件培养；发酵罐f为实验组，转入二级种子后同时将其它发酵罐的后期发酵液(效价为2836μ/ml，麦迪霉素a1所占比例为37.2％，吉他霉素a6所占比例为19.7％)转入发酵罐同步培养，后期发酵液添加量为1％，两个罐均在罐压0.02-0.03mpa，26℃培养56h放罐。经测定对照组发酵罐e的效价为2863μ/ml，麦迪霉素a1比为38.1％，吉他霉素a6比为19.1％；实验组发酵罐f的效价为3608μ/ml，麦迪霉素a1比为42.9％，吉他霉素a6比为23.2％。实验组比对照组效价提高20.6％，麦迪霉素a1所占比例提高11.2％，吉他霉素a6所占比例提高17.6％。其他操作基本同实施例1。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。