波罗的海希瓦氏菌噬菌体SppYZU01及其用途的制作方法

本发明涉及一种波罗的海希瓦氏菌噬菌体分离株sppyzu01，及其作为食品添加成分或生物抑菌剂在食品生产和保藏中的抑菌应用，尤其是能够抑制冷藏的淡水或海水产品中由波罗的海希瓦氏菌增殖引起的腐败变质，延长产品货架期。属于生物工程领域。

背景技术：

波罗的海希瓦氏菌(shewanellabaltica)是水产品及肉制品中的主要嗜冷腐败菌，在低温贮藏(0-5℃)条件下生长快，腐败能力强，最终形成腐败过程中的优势菌群，并产生组胺、硫、吲哚、醛、三甲胺等代谢物，导致感官品质的劣变，给水产及肉品加工业造成严重的经济损失。有效抑制这类细菌的繁殖及交叉污染，是维持低温水产品及肉制品鲜度，延长货架期的重要手段。目前用于控制食品中腐败细菌生长的常规抑菌剂主要有化学防腐剂，近年来出于对食品安全和绿色保鲜的需求，人们利用从动植物、微生物中提取的对人体安全无害的天然成分作为生物抑菌剂，主要包括大蒜素、茶多酚、溶菌酶、乳酸链球菌素等。这些抑菌剂虽能满足顾客对食品安全的需求，但是存在低温环境中保鲜效果不佳、制备成本高、改变食品的颜色和风味等缺陷。此外，希瓦氏菌在适应自然环境生长过程中，在食品、加工器具的表面形成生物被膜，被膜内的细菌对常规保鲜剂、抑菌剂的抵抗能力提高数百倍，很难被清除，从而导致持续性污染，给水产品和肉制品加工和保鲜带来严重危害。因此亟需开发新的生物保鲜剂和抑菌剂。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。噬菌体广泛存在于自然界中，并且对宿主菌具有专一性，制备成本低廉，安全性好。在水产和肉制品冷藏保鲜中，应用噬菌体作为生物保鲜剂来控制波罗的海希瓦氏菌被膜形成及生长代谢，具有潜在的开发价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种对波罗的海希瓦氏菌具有强裂解作用的噬菌体分离物或制剂，该制剂可以单独或复配作为保鲜剂的主要成分，在常温或冷藏条件下有效抑制食品中的波罗的海希瓦氏菌生长与代谢，为食品保鲜和货架期延长提供一种安全、高效、廉价的噬菌体产品。

本发明所述的一种波罗的海希瓦氏菌噬菌体(shewanellabalticaphage)，是sppyzu01，其保藏编号为cctccno：m2016715。

本发明进一步提供了该噬菌体在制备保鲜剂或抑菌剂中的应用。

公开了该菌用于抑制水产品和肉制品中由波罗的海希瓦氏菌引起的腐败的用用途。

公开了在食品保鲜及其生产环境或保藏运输器具的清洗除菌中的应用。

本发明还提供了一种波罗的海希瓦氏菌抑菌剂，是以所述的噬菌体sppyzu01的分离物或培养物作为食品保鲜或抑菌剂成分。

本发明从农贸市场采集的污水样品中分离出一株波罗的海希瓦氏菌噬菌体sppyzu01(shewanellabalticaphagesppyzu01)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctccno：m2016715；保藏日期：2016年12月2日。

本发明中的波罗的海希瓦氏菌噬菌体sppyzu01具有以下生物学特征：

(1)形态学特征：通过透射电镜观察，头部对称，直径约为55nm，尾长约为160nm，具有伸缩性尾鞘，形态学特征归于肌尾噬菌体科。

(2)噬菌体核酸类型：噬菌体为dsdna。

(3)噬菌体基因组特征：sppyzu01基因组全长为43567bp，其中编码基因总长度分别为40884bp，平均长度为834bp，占总长的93.84％，gc含量分别为55.72％，有49个开放阅读框(orfs)。sppyzu01的49个orfs编码蛋白中有12个orfs在数据库中未找到同源性基因，37个orfs编码的蛋白找到同源性序列，其中包括25个假设蛋白(hypotheticalprotein)，和12个已知蛋白功能的序列。在genbank数据库中并没有波罗的海希瓦氏菌噬菌体的全基因组序列及相关基因，数据显示sppyzu01是一株新的噬菌体。

(4)具有强烈的波罗的海希瓦氏菌裂解性能。

(5)能够抑制波罗的海希瓦氏菌生物被膜形成。

本发明将上述的波罗的海希瓦氏菌噬菌体sppyzu01制备成一种希瓦氏菌噬菌体抑菌剂，用于控制食品加工与贮藏中波罗的海希瓦氏菌引起的腐败。分别取100μlsppyzu01噬菌体液与相应对数期生长期的波罗的海希瓦氏菌液100μl混合，室温放置10min，然后加到10mllb液体培养基中，25℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经5000×g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加0.93gpeg8000，0.58gnacl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000×g4℃离心20min，去上清液；加0.5mlsm(1l：nacl5.8g，mgso4.7h2o2.0g，1mtris-hcl(ph7.4)50ml)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000×g4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的sppyzu01噬菌体颗粒与sm缓冲液按1：10比例混合形成噬菌体抑菌剂母液。

由本发明波罗的海希瓦氏菌噬菌体制成的抑菌剂的应用是指：将纯化的波罗的海希瓦氏菌噬菌体用水稀释并制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中造成的腐败希瓦氏菌污染；或者将纯化的波罗的海希瓦氏菌噬菌体作为食品添加剂，在配料和贮藏时加入纯化的噬菌体，用于防止食品加工以及储存过程中波罗的海希瓦氏菌代谢和繁殖。

本发明中所述的食品是指：由水产品(包含淡水和海水产品)，或肉类，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

本发明采用噬菌体sppyzu01能特异性裂解波罗的海希瓦氏菌，在冷藏条件下可以有效抑制波罗的海希瓦氏菌代谢和繁殖，保持水产品和肉制品的鲜度，延长贮藏期；由于本发明涉及的噬菌体sppyzu01可以抑制菌膜形成，通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具上的波罗的海希瓦氏菌进行清除，减少该菌对食品的交叉污染；由于本发明涉及的噬菌体属于天然生物材料，基因组中不含任何毒力基因，没有毒副作用，可以作为食品生物保鲜剂或抑菌剂。

附图说明

图1是不同噬菌体分离株的抑菌能力比较。

图2噬菌体sppyzu01单层平板抑菌结果。

图3噬菌体sppyzu01电镜照片。

图4噬菌体sppyzu01全基因组图谱。

图5噬菌体sppyzu01对菌膜形成的抑制效果，其中，control表示未加噬菌体的对照组；blank表示纯培养基空白对照组；a、b、c、d、e组表示加10⁴pfu/ml、10⁵pfu/ml、10⁶pfu/ml、10⁷pfu/ml、10⁸pfu/ml浓度的sppyzu01处理组，每组5个平行，星号表示与对照组差异极显著(p<0.001)。

图6噬菌体sppyzu01在鱼汁保藏过程中的抑菌作用，其中，实心数据点表示未加噬菌体的对照组；空心数据点为添加噬菌体的实验组；圆形数据点为25℃贮藏测定结果；方形数据为4℃贮藏测定的结果。

图7噬菌体sppyzu01在鱼片保藏过程中的抑菌作用，其中，实心数据点表示未经噬菌体处理的鱼片(对照组)；空心数据点为噬菌体组合处理的鱼片(实验组)；圆形数据点为25℃贮藏测定结果；方形数据点为4℃贮藏测定的结果。

图8噬菌体sppyzu01在鱼片保藏过程中的保鲜效果，其中，黑色柱状图表示未经噬菌体处理的鱼片(对照组)；白色柱状图为噬菌体组合处理的鱼片(实验组)；图a为25℃贮藏鱼片测定结果；图b为4℃贮藏测定的结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本发明试验用噬菌体宿主菌波罗的海希瓦氏菌(shewanellabaltica)syzu01，由扬州大学食品微生物实验室分离自低温贮藏中腐败的淡水鱼，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctccno：m2016794；保藏日期：2016年12月2日；分类命名为：波罗的海希瓦氏菌syzu01，shewanellabalticasyzu01

本发明试验使用的波罗的海希瓦氏菌噬菌体sppyzu01(shewanellabalticaphagesppyzu01)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctccno：m2016715；保藏日期：2016年12月2日；分类命名为：波罗的海希瓦氏菌噬菌体sppyzu01(shewanellabalticaphagesppyzu01)。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

实施例1、噬菌体分离及纯化制备

噬菌体分离

本发明样品采自江苏扬州农贸市场污水，取30ml污水样品放入50ml离心管中，5000×g离心10min，取5ml上清液加入到5mllb液体培养基中，同时加入100μl对数生长期的波罗的海希瓦氏菌syzu01，放置25℃摇床过夜培养，次日，将试管中的培养物转至无菌离心管中，4℃，5000×g离心10min，取上清过0.22μm滤膜，得到噬菌体原液，放置4℃冰箱保存。

用无菌的sm缓冲液对噬菌体原液进行倍比稀释，取合适稀释度的噬菌体液100μl与100μl对数生长期的波罗的海希瓦氏菌syzu01在室温下混合10min，再加入5mllb半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的lb固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在25℃恒温培养箱中培养。

在上述出现噬菌斑的双层平板上挑取透明单个空斑至1mlsm缓冲液中，混匀，4℃放置24h；次日用无菌的sm缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释，取合适稀释度的噬菌体液体100μl与100μl对数生长期的波罗的海希瓦氏菌在室温下混合10min，再加入5mllb半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的lb固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在25℃恒温培养箱中培养。重复双层平板法的操作3次，得到的噬菌斑大小一致后，即认为分离到的是纯的噬菌体。分离获得的噬菌体，得到分离株sppyzu01、sppyzu01-1、sppyzu01-2、sppyzu01-3、sppyzu01-4。

分别取10μl波罗的海希瓦氏菌噬菌体分离株sppyzu01、sppyzu01-1、sppyzu01-2、sppyzu01-3、sppyzu01-4的悬液与100μl对数期生长期的波罗的海希瓦氏菌syzu01混合，以同体积的sm缓冲液为对照(blank)，室温放置10min，然后加到20mllb液体培养基中，接种物放置在25℃培养箱中恒温培养，在0h、24h、48h取样1ml，用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于比较不同噬菌体分离株的抑菌能力。结果如图1所示，sppyzu01在24h和48h的od600nm均显著小于其他的噬菌体分离株(p<0.01)，表明具有最强的抑制能力。

噬菌体的纯化

分别取100μl分离得到的波罗的海希瓦氏菌噬菌体(sppyzu01)液分别与对数期生长期的波罗的海希瓦氏菌液100μl混合，室温放置10min，然后加到10mllb液体培养基中，25℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经5000×g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加0.93gpeg8000，0.58gnacl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000×g4℃离心20min，去上清液；加0.5mlsm(1l：nacl5.8g，mgso4.7h2o2.0g，1mtris-hcl(ph7.4)50ml)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000×g4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。获得纯化的噬菌体，用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。结果显示sppyzu01对波罗的海希瓦氏菌产生强烈的裂解效应(如图2所示)。

噬菌体形态特征

用透射电镜观察噬菌体形态特征。采用磷钨酸负染色法，将铜网有膜的一面朝上，取10μl高效价噬菌体液滴于铜网上，吸附15min后用吸水纸吸干水分，取出铜网，在空气中自然干燥2-3min。然后在铜网上滴一滴2％的磷钨酸(pta)水溶液进行染色，2min后取下，用吸水纸吸干水分，在空气中干燥5min，用透射电镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。

结果如图3所示，噬菌体sppyzu01头部对称，直径约为55nm，尾长约为160nm，具有伸缩性尾鞘，形态学特征归于肌尾噬菌体科。

噬菌体基因组特征

将纯化的噬菌体sppyzu01悬液加dnasei至终浓度5μg/ml，rnasea至1μg/ml，37℃温育1h；加入edta(ph8.0)至终浓度20mmol/l；加蛋白酶k至终浓度50μg/ml，加sds至终浓度0.5％，混匀，56℃×1h；加入等体积平衡酚(ph8.0)振荡抽提，5000×g，离心10min，收集上层水相；用等体积氯仿再抽提一次，5000×g，离心10min，收集上层水相；加入1/10体积3mol/lnaac(ph5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃，12000×g离心10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀；用适量te(ph8.0)混悬沉淀，在genequant核酸定量仪上粗略定量，暂按dsdna设置参数，-20℃保存；提取的噬菌体dna送至深圳恒创基因生物有限公司由illuminahiseq2500pe150平台进行全基因组测序及分析。

结果如图4所示，sppyzu01基因组全长为43567bp，其中编码基因总长度分别为40884bp，平均长度为834bp，占总长的93.84％，gc含量分别为55.72％，有49个开放阅读框(orfs)。

sppyzu01的49个orfs编码蛋白中有12个orfs在数据库中未找到同源性基因，37个orfs编码的蛋白找到同源性序列，其中包括25个假设蛋白(hypotheticalprotein)，和12个已知蛋白功能的序列。在genbank数据库中并没有波罗的海希瓦氏菌噬菌体的全基因组序列及相关基因，数据显示sppyzu01是一株新的噬菌体。sppyzu01基因组中不含有已知的毒力相关基因。

实施例2、噬菌体sppyzu01对波罗的海希瓦氏菌生物被膜的抑制作用

取对数生长期的波罗的海希瓦氏菌syzu01用营养肉汤培养基进行稀释，最终浓度为1×10⁷cfu/ml，实验组：在无菌96孔板中每孔分别加入稀释菌液(10⁷cfu/ml)和噬菌体sppyzu01悬液(10⁴pfu/ml、10⁵pfu/ml、10⁶pfu/ml、10⁷pfu/ml、10⁸pfu/ml)各150μl；对照组：在无菌96孔板中每孔加入稀释菌液(10⁷cfu/ml)和营养肉汤培养基各150μl；空白组：每孔加300μl营养肉汤培养基；37℃培养24h；取出96孔板，吸出悬浮菌液，用无菌pbs清洗96孔板3次，吹干，充分除去浮游菌体；每孔加入200μl浓度为0.2％的结晶紫染色液，染色30min；吸出染色液，用无菌pbs彻底清洗96孔板至洗出液呈无色，吹干；每孔加入200μl的33％醋酸脱色剂，振荡充分溶解，于酶标仪测定600nm处的od值。每组平行测定5次。

结果如图5所示，加入10⁵pfu/ml、10⁶pfu/ml、10⁷pfu/ml、10⁸pfu/mlsppyzu01悬液的试验组(b、c、d、e组)测的od600nm显著低于对照组(p<0.001)，表明高于10⁵pfu/ml浓度的sppyzu05能够显著抑制波罗的海希瓦氏菌生物膜的形成。

实施例3、噬菌体sppyzu01在鱼汁贮藏过程中的抑菌作用

将新鲜草鱼宰杀后，取鱼背脊两侧肉，去皮，剪成细条，称重，按水的体积和鱼肉质量比例为2：1，加水煮沸5min后，用纱布过滤，重新添加水，恢复至第一次添加量，继续煮沸5min，用滤纸过滤，用naoh将滤液ph调整为7，每升鱼汁中加入40mgl-半胱氨酸和40mgl-甲硫氨酸，分装至锥形瓶中，121℃灭菌15min。将波罗的海希瓦氏菌syzu01按10⁶cfu/ml浓度接种到30ml鱼汁中，实验组中加入30μl噬菌体sppyzu01悬液(10⁸pfu/ml)，对照组中加入30μlsm缓冲液，接种物分别放置在25℃培养箱以及4℃冰箱中恒温保藏，25℃培养的培养物每隔12h取样1ml，4℃培养的培养物每隔1天取样1ml，用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于分析。

结果如图6所示，随着贮藏时间延长，对照组od600nm快速增长，分别在第2天(25℃)和第7d(4℃)时达到1.12和0.98，而添加sppyzu01悬液的实验组od600nm始终保持在较低的水平(od600<0.2)，表明本发明中的sppyzu01噬菌体在25℃和4℃条件下均能对波罗的海希瓦氏菌起到显著抑制作用(p<0.01)。

实施例4、噬菌体sppyzu01在鱼片贮藏过程中的抑菌作用

采集新鲜草鱼背部肌肉并分成60份，平均每份10g。用次氯酸钠浸泡15min，无菌水漂洗5遍，捞出沥干；用波罗的海希瓦氏菌悬液浸泡10min，捞出沥干；对照组用sm缓冲液浸泡10min，实验组用噬菌体sppyzu01悬液浸泡10min，捞出沥干，装入聚乙烯薄膜袋中，置于4℃和25℃下恒温贮藏。4℃保藏0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d以及25℃保藏0h、12h、24h、36h、48h取样测定菌落细菌总数(tac)，考察抑菌作用。

25℃和4℃贮藏条件下细菌总数(tac)测定结果如图7。在两种贮藏温度下，贮藏初期对照组和实验组细菌总数分别为：3.21logcfu/g和3.17logcfu/g，随着贮藏时间的增加，噬菌体浸泡处理的鱼片细菌总数在整个贮藏期始终低于对照组，比对照组分别减少了4.1logcfu/g和3.96logcfu/g，表明本发明中的噬菌体sppyzu01悬液在两种贮藏温度对鱼片中的波罗的海希瓦氏菌均起到显著的抑菌作用。

实施例5、噬菌体sppyzu01在鱼片冷藏过程中的保鲜效果

采集新鲜草鱼背部肌肉并分成60份，平均每份10g。用次氯酸钠浸泡15min，无菌水漂洗5遍，捞出沥干；用波罗的海希瓦氏菌株悬液浸泡10min，捞出沥干；对照组用sm缓冲液浸泡10min，实验组用噬菌体sppyzu01悬液浸泡10min，捞出沥干，装入聚乙烯薄膜袋中，置于4℃和25℃下恒温贮藏。4℃保藏0d、4d、8d、12d以及25℃保藏0h、24h、48h取样测定测定挥发性盐基氮(tvb-n)值，考察鲜度变化。tvb-n值测定参照gb/t5009.44-2003，采用半微量定氮法进行测定。

测定结果如图8。根据现有的研究结果，鱼制品tvb-n值在20mgn/100g为鲜度终点，而在35mgn/100g则为完全腐败。在常温(25℃)和低温(4℃)贮藏条件下，对照组分别在2d和8d时，tvb-n值超过35mgn/100g，达到完全腐败。而实验组(噬菌体sppyzu01浸泡处理的鱼片)分别在第2d和8dtvb-n值保持在22.5和17.6mgn/100g，在两种温度贮藏终点，tvb-n值均未超过35mgn/100g。结果表明本发明中的噬菌体sppyzu01在两种贮藏温度下均显著抑制了波罗的海希瓦氏菌引起的tvb-n值上升，起到维持鲜度，延长保藏期作用。