一种利用选择性抑制剂研究产甲烷代谢途径的方法与流程

本发明涉及有机废弃物生物处理技术、环保净化处理技术领域，尤其涉及一种利用选择性抑制剂研究产甲烷代谢途径的方法。

背景技术：

厌氧发酵技术是目前处理有机固体废弃物或有机废水较为合理的处理技术之一。但厌氧状态下有机物逐渐分解为小分子有机物并最终转化生成甲烷是一个由多种微生物相互协同、共同完成的复杂过程。首先纤维素、蛋白质和脂类等复杂有机物首先在严格厌氧菌的作用下降解成可溶性小分子；产酸菌进而将小分子转化成挥发性脂肪酸(vfas)，vfas被产氢产乙酸菌转化为乙酸和h2；最后，h2、co2和vfas的混合物在嗜乙酸产甲烷菌和嗜氢产甲烷菌的作用下生成甲烷。目前，一般将厌氧消化产甲烷过程分为四个阶段，即水解阶段、产酸阶段、产氢产乙酸阶段和产甲烷阶段，如说明书附图1所示，挥发性脂肪酸(vfas)尤其是乙酸的分解过程是非常关键的。在厌氧消化过程中，乙酸主要通过两种途径被降解。一方面，乙酸可以通过嗜乙酸产甲烷过程(am)被转化为ch4和co2；另一方面，乙酸可以通过乙酸氧化过程(sao)在乙酸氧化菌(saob)的作用下转化为h2和co2，进而通过嗜氢产甲烷过程(hm)转化为ch4。

关于产甲烷代谢途径的研究，目前有很多方法，如稳定性同位素技术。基于光谱学技术的稳定性同位素组成分析可以实现甲烷化过程中碳同位素的在线监测，即使是在大型沼气反应器中，根据产生沼气中稳定性同位素的特性亦可确定反应器中主要的产甲烷途径。然而，该技术在应用过程中面临的主要问题是费用相对较高。采用抑制剂对不同的代谢途径进行选择性抑制也可以实现对代谢机理的定量化研究，目前，选择性抑制手段在产甲烷代谢途径中的应用已被广泛接受，然而不同的厌氧消化过程，由于其代谢途径的不同而导致抑制剂的投加浓度存在较大差异。

技术实现要素：

基于上述现象，本发明提供一种利用选择性抑制剂研究产甲烷代谢途径的方法，技术方案如下：一种利用选择性抑制剂研究产甲烷代谢途径的方法，借助选择性抑制手段，利用不同抑制剂选择性地抑制目标途径，根据不同抑制条件下的甲烷产量，定性地判断产厌氧消化过程甲烷代谢途径，并定量地判断各种代谢途径对系统产甲烷的贡献率；所述抑制剂为二溴乙烷磺酸盐(bes)、氟乙酸盐(fluoroacetate)和无水茶碱(lumazine)

步骤如下:

s1,利用全自动甲烷潜力分析系统(amptsⅱ)，生产公司为瑞典bioprocesscontrol公司，接种产甲烷厌氧污泥(该污泥已经经过氨氮耐受性驯化)；

s2,以乙酸盐为底物，添加不同的抑制剂，进行连续厌氧发酵实验；其中所述接种产甲烷厌氧污泥的ts和vs含量分别为4.21％和3.38％；

s3,通过预实验，确定抑制剂的最适投加量，确定产甲烷代谢途径；

s3过程如下：投加一定量的二溴乙烷磺酸盐(bes)，可完全抑制甲烷生产；投加一定量的氟乙酸盐(fluoroacetate)，抑制am途径产生的甲烷；

投加一定量的无水茶碱(lumazine)，抑制hm途径产生的甲烷；

投加二溴乙烷磺酸盐(bes)浓度为80mm完全抑制甲烷形成；投加氟乙酸盐抑制am途径的最适浓度为0.1mm；投加无水茶碱抑制hm途径的最适浓度1.5mm。

对于氨氮耐受污泥厌氧消化体系，投加二溴乙烷磺酸盐(bes)浓度为80mm，vfas基本未被利用，可确定基本完全抑制甲烷生产；投加氟乙酸盐浓度为0.1mm，vfas的下降幅度较大，有一定的甲烷产量，累积甲烷产量及vfas的变化，可基本确定抑制am途径产生的甲烷；投加无水茶碱浓度1.5mm，绝大部分的vfas未被消耗，但有一定的甲烷产量，累积甲烷产量及vfas的变化，可基本确定当hm途径受到抑制时，sao过程也受到了影响。

添加不同的抑制剂后，累积甲烷产量和vfas的变化趋势有较大差异，根据对照组的累积甲烷产量，投加氟乙酸盐抑制am途径后，累积甲烷产量是对照组的92.26％；投加无水茶碱抑制hm途径后，累积甲烷产量是对照组的8.39％；投加bes抑制所有甲烷化过程后，累积甲烷产量对照组的3.22％；可以确定，约8％的甲烷是通过am途径产生的，约有92％的甲烷是通过hm途径产生的。本发明的有益效果：

1、本发明利用不同的产甲烷途径抑制剂对产甲烷代谢途径进行研究，原理简单，易控制，无需采用稳定性同位素示踪等复杂手段。

2、本发明在确定厌氧消化产甲烷途径的同时，还可明确am途径以及sao-hm途径对产甲烷的贡献率，为后期的实验调控提供了科学依据。

附图说明

图1是目前厌氧消化产甲烷过程的结构示意图；

图2是本发明中厌氧污泥分解乙酸产甲烷的途径及抑制剂选择的结构示意图；

图3是本发明中不同bes浓度实验组的累积甲烷产量及vfas变化趋势图；

图4是本发明中不同氟乙酸盐浓度实验组的累积甲烷产量及vfas变化趋势图；

图5是本发明中不同无水茶碱浓度实验组的累积甲烷产量及vfas变化趋势；

图6是本发明中加入不同抑制剂条件下的累积甲烷产量及vfas浓度的变化趋势图。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅供说明具体结构，该结构的规模不受实施例的限制。

如图2所示，一种利用选择性抑制剂研究产甲烷代谢途径的方法，借助选择性抑制手段，利用不同抑制剂选择性地抑制目标途径，根据不同抑制条件下的甲烷产量，定性地判断产厌氧消化过程甲烷代谢途径，并定量地判断各种代谢途径对系统产甲烷的贡献率；所述抑制剂为二溴乙烷磺酸盐(bes)、氟乙酸盐(fluoroacetate)和无水茶碱(lumazine)

步骤如下:

s1,利用全自动甲烷潜力分析系统(amptsⅱ)，瑞典bioprocesscontrol公司，接种产甲烷厌氧污泥(该污泥已经经过氨氮耐受性驯化)；

s2,以乙酸盐为底物，添加不同的抑制剂，进行连续厌氧发酵实验；其中所述接种产甲烷厌氧污泥的ts和vs含量分别为4.21％和3.38％；

s3,通过预实验，确定抑制剂的最适投加量，确定产甲烷代谢途径；

s3过程如下：投加一定量的二溴乙烷磺酸盐(bes)，可完全抑制甲烷生产；投加一定量的氟乙酸盐(fluoroacetate)，抑制am途径产生的甲烷；

投加一定量的无水茶碱(lumazine)，抑制hm途径产生的甲烷；

投加二溴乙烷磺酸盐(bes)浓度为80mm完全抑制甲烷形成；投加氟乙酸盐抑制am途径的最适浓度为0.1mm；投加无水茶碱抑制hm途径的最适浓度1.5mm。

为了解不同抑制剂浓度对高氨氮负荷下氨氮耐受污泥产甲烷过程的影响，选取了不同的抑制浓度范围，得到累积甲烷产量及vfas的变化趋势。

如图3，对照组的累积甲烷产量为151ml，添加10mm的bes后，累积甲烷产量为141，较对照组下降了6.62％；当bes浓度提高至50mm时，刚开始，对甲烷产生有一定抑制，但是实验后期，甲烷产量又迅速上升，至实验结束时，累积甲烷产量达117ml，较对照组下降了22.52％；继续提高bes浓度至80mm、100mm和120mm时，仅在实验初始阶段内有一定的甲烷产生，随后完全抑制，至实验结束时，累积甲烷产量分别为30ml、28ml和16ml。本研究认为，如图3，实验开始后，对照组的vfas迅速下降，至实验结束时，vfas的浓度仅有约50mg/l；当bes浓度分别为10mm和50mm时，实验结束时vfas分别为150和300mg/l，vfas的利用受到了一定程度的抑制；继续提高vfas浓度至80mm、100mm和120mm时，实验结束时，vfas浓度仍849mg/l、960mg/l和981mg/l，说明vfas基本未被利用；因此，综合考虑累积甲烷产量及vfas的下降趋势，对于氨氮耐受污泥厌氧消化体系，基本完全抑制甲烷生产的浓度为80mm。

如图4，氟乙酸钠的投加量分别为0.05mm、0.08mm和0.1mm时，对产甲烷过程的抑制程度相对较低，实验结束时，甲烷产量分别为146ml、138ml和135ml；这可能是由于该体系中嗜乙酸产甲烷途径所占比例较小造成的。有可能大部分乙酸通过sao及hm途径产生甲烷，从而投加低于0.1mm的氟乙酸钠只能抑制am途径产生的甲烷；此时，vfas的下降幅度也较大，氟乙酸钠的投加量分别为0.05mm、0.08mm和0.1mm时，vfas的浓度分别为52mg/l、55mg/l和56mg/l；但是继续增加氟乙酸钠的投加量，累积甲烷产量明显下降，vfas的消耗也受到了一定程度的抑制；因此高浓度的氟乙酸钠，除了抑制am途径的甲烷产生，也影响了saob的活性，从而影响了乙酸的分解，进而影响甲烷的产量；综合考虑累积甲烷产量及vfas的变化趋势，本研究选择的氟乙酸盐的最适浓度为0.1mm，高于此浓度，可能会抑制sao过程。

如图5所示，无水茶碱的投加量分别为0.2mm、0.5mm和1mm时，产甲烷过程受到了不同程度的抑制，甲烷产量分别为135ml、114ml和61ml，实验结束时vfas的浓度分别为144mg/l、278mg/l和630mg/l；当继续加大无水茶碱的投加量时，甲烷过程基本完全抑制，无水茶碱的投加量为1.5mm和2mm时，实验结束时累积甲烷产量仅有15和12ml，而vfas的浓度仍有约933mg/l和943mg/l，绝大部分的vfas未被消耗；当hm途径受到抑制时，sao过程也受到了影响，因为热力学上sao过程是不可行的(吉布斯自由能为正值)，综合考虑累积甲烷产量及vfas的变化趋势，本研究选择的无水茶碱最适浓度为1.5mm。

根据上述实验结果，三种抑制剂bes、氟乙酸盐和无水茶碱的选取浓度分别为80mm、0.1mm和1.5mm。根据三种抑制剂的最适浓度，抑制产甲烷过程的不同途径，从而间接地分析氨氮耐受污泥厌氧消化体系中的产甲烷代谢途径。

如图6所示，添加不同的抑制剂后，累积甲烷产量和vfas的变化趋势有较大差异；对照组的累积甲烷产量为155ml，投加氟乙酸钠抑制am途径后，累积甲烷产量达143ml，是对照组的92.26％；投加无水茶碱抑制hm途径后，累积甲烷产量仅13ml，是对照组的8.39％；投加bes抑制所有甲烷化过程后，累积甲烷产量只有5ml，是对照组的3.22％。从产气量的角度考虑，可以确定，约8％的甲烷是通过am途径产生的，约有92％的甲烷是通过hm途径产生的。本发明中厌氧消化底物是乙酸，若通过hm产生甲烷，则必须通过sao途径将乙酸分解为h2和co2，进而通过hm途径形成甲烷；当投加氟乙酸钠后，乙酸的浓度仍然有较大幅度的降低，实验结束时，vfas浓度为97mg/l，是初始浓度的9.7％，说明投加氟乙酸钠抑制am途径后，仍然有90.3％的乙酸被降解，而在厌氧环境中乙酸的降解只有am和sao途径，因此可以推断该系统中存在大量的saob菌，在am途径受到抑制的条件下，能够将乙酸分解。同时，当投加hm途径抑制剂无水茶碱后，乙酸的减少甚微，至实验结束时，体系中vfas浓度仍有901mg/l；投加bes时，vfas浓度是959mg/l。因此，hm途径受到抑制后，乙酸的降解也相应受到了抑制，这与sao过程与hm过程的共生关系是相对应的。厌氧消化体系中，在saob的作用下，乙酸分解为h2和co2的过程是热力学不可行的，必须借助hm过程降低h2的分压，才能保证分解过程的正常进行，这一过程即“种间氢转移”，因此saob和嗜氢产甲烷菌之间存在共生的关系。从抑制hm途径而乙酸分解也受到限制可以推测，该氨氮耐受污泥体系中，90％的乙酸分解是通过sao-hm途径完成的，仅有10％的分解是通过am完成的，这与累积甲烷产量的分析基本吻合。综合考虑累积甲烷产量及vfas的分解过程，氨氮耐受污泥厌氧消化体系中，约有90％的甲烷是通过sao-hm途径形成，约有10％的甲烷是通过am途径形成。