胆酸‑非洲爪蟾胰高血糖素样肽‑1缀合肽及其应用的制作方法

本发明涉及一类非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(xenglp-1)类似物及其应用

背景技术：

糖尿病(diabetesmellitus,dm)是一种全球性的内分泌代谢疾病,表现在因胰岛素分泌不足而引起的糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱及体内酸碱失衡,以血糖水平升高为主要特征。根据体内胰岛素的缺失、及受损情况将糖尿病分为：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病及其他类型糖尿病。其中2型糖尿病占比90％。根据国际糖尿病联盟(idf)统计，2015年全球糖尿病患者约有4.15亿人，每11个人就有1人患有糖尿病。预测到2040年，全球将会有6.42亿人患有糖尿病，中国糖尿病患者也将达到1.51亿。目前,临床中糖尿病的治疗方法包括注射胰岛素和口服降血糖药物,但这些方法在长期使用中会产生毒副作用,因此,寻找天然的、无毒的降血糖药物是非常必要的。

胰高血糖素样肽-1(glp-1)具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用，作为一种肠源性激素，glp-1是在营养物质特别是碳水化合物的刺激下才释放入血的,其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性。glp-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了临床糖尿病治疗中病人常产生低血糖症的危险，另外glp-1几乎含盖了现有糖尿病治疗药物的所有优点，能从根本上改善2型糖尿病患者的症状，因此开发glp-1作为一种i2型糖尿病治疗药物具有良好的前景。然而人体内二肽基肽酶(dipeptidyl-peptidase，dpp-iv)和中性肽链内切酶(neutralendopeptidase，nep24.11)会快速降解glp-1，造成glp-1在体内半衰期很短(1～2min)，这限制了其在临床上的应用。因此，需要我们寻找和glp-1具有相似的生物活性，但能在体内长效作用的新型glp-1受体激动剂。目前，大部分的glp-1受体激动剂的研究都是在glp-1肽序的基础上进行结构改造和化学修饰，以延长其半衰期，这在极大程度上限制了新型glp-1受体激动剂的研发。

非洲爪蟾glp-1(xenglp-1)的降糖活性优于天然glp-1，另外其特殊的氨基酸序列使其具有更好的体内稳定性，是一个优良的先导多肽。天然产物中的胆酸类化合物有比较强的血清蛋白结合率，血清白蛋白结合以后的药物与游离药物在体内产生平衡，缓慢释放实现长效化。同时血清白蛋白结合药物不易被肾小球滤过，可以避免肾脏的滤过代谢。所以，我们设计了以胆酸为母核的化合物，通过glu和不同长度的脂肪链与xenglp-1的肽链相连接。

技术实现要素：

本发明涉及一类非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(xenglp-1)类似物，其序列为：

his-xaa1-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-glu-ala-ala-xaa2-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-xaa3-gly-xaa4-xaa5(seq.idno:1)

其中：

xaa1:ala，gly或aib；

xaa2:lys(cholicacidanalog)或lys；

xaa3:lys(cholicacidanalog)或lys；

xaa4:lys(cholicacidanalog)或lys；

xaa5:pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2，pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys

-lys-lys-lys-lys-nh2或-nh2；

前提是所述序列不是his-xaa1-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu

-glu-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-nh2,

his-xaa1-glu-gly-thr-tyr-thr

-asn-asp-val-thr-glu-tyr-leu-glu-glu-glu-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2或his-xaa1-glu-gly-thr-tyr-thr-asn-asp-val-thr-

glu-tyr-leu-glu-glu-glu-ala-ala-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-lys-gly-lys-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2；

以及该类似物所成的可药用的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该类似物基础上的药物前体，或上述形式类似物的任意混合物。

其中lys(cholicacidanalog)选自

这里：n选自4～18。

其中优选的lys(cholicacidanalog)结构为

优选的xenglp-1类似物的氨基酸序列如seq.idno:2-7所示。

本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述xenglp-1类似物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、螯合物或非共价复合物，基于该类似物基础上的药物前体，或上述形式类似物的任意混合物，和一种或者多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明进一步提供了上述xenglp-1类似物或其药学上可接受的盐或药物组合物在药物中的应用。

本发明涉及的xenglp-1类似物，以liraglutide及semaglutide为对照，在体外实验中利用高度表达glp-1受体的hek293细胞模型，评价其体外受体激动活性。并利用人血浆温敷，评价其体外稳定性。在体内实验中，以糖尿病小鼠及肥胖小鼠为实验模型，鉴定其长效降血糖及减肥效果。体外和体内实验结果表明，本发明提供的xenglp-1类似物具有极高的体外稳定性，并且其降血糖作用时间及减肥效果优于liraglutide及semaglutide。

本发明的优点在于：

本发明所涉及的非洲爪蟾glp-1(xenglp-1)类似物，由于其特殊的氨基酸序列，其体内稳定性显著的优于天然glp-1，进一步利用胆酸修饰所得到的xenglp-1类似物，其体内降糖作用时间和减肥作用显著优于以glp-1肽链为主体的liraglutide及semaglutide，可以广泛的应用于糖尿病及肥胖的治疗。

附图说明

上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中：图1显示的是xenglp-1类似物体外血浆稳定性实验的降解图；

图2显示的是xenglp-1类似物长效降糖实验的血糖-时间曲线图；

图3显示的是xenglp-1类似物降低体重实验的体重变化曲线图。

具体实施方式

在本说明书全文中采用以下缩写：

dmf：二甲基甲酰胺；dcm：二氯甲烷；fmoc：n-9-芴甲氧羰基；dic：n,n’-二异丙基碳二亚胺；hobt：1-羟基-苯并三氮唑；tfa：三氟乙酸；edt：二巯基乙烷；hplc：高效液相色谱；esi-ms：电喷雾质谱；lc-ms：液质联用质谱；gly：甘氨酸；ser：丝氨酸；ala：丙氨酸；thr：苏氨酸；val：缬氨酸；ile：异亮氨酸；leu：亮氨酸；tyr：酪氨酸；phe：苯丙氨酸；his：组氨酸；pro：脯氨酸；asp：天门冬氨酸；met：蛋氨酸；glu：谷氨酸；trp：色氨酸；lys：赖氨酸；arg：精氨酸；asn：天冬酰胺；gln：谷氨酰胺；cys：半胱氨酸。

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施实例1

(1)树脂的溶胀

称取担载量为0.382mmol/g的rinkamidembha树脂0.262g(0.1mmol)，放入25ml的反应器中，用7ml的dcm和甲醇交替清洗树脂1次，7ml的dcm清洗树脂2次，然后用7ml的dcm溶胀树脂1h，最后用7mldmf清洗树脂3次。

(2)树脂fmoc保护基的脱除

将溶胀后的树脂转入多肽合成仪，加入7ml20％哌啶/dmf室温反应5min，滤去脱保护溶液，7mldmf清洗树脂一次，再加入7ml20％哌啶/dmf脱保护清洗树脂15min，最后7mldmf清洗树脂4次，每次1.5min，得到脱除fmoc保护基的rink树脂。

(3)fmoc-lys-rinkamide-mbharesin的合成

称fmoc-lys(boc)-oh(0.4mmol)，用3ml10％dmf/dmso溶解，加入2mldic/hobt(0.4mmol/0.44mmol)，搅拌30min后，将活化好的氨基酸加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用7mldmf清洗树脂4次。

(5)肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。其中脂肪酸化位点的lys使用具有特殊侧链保护基的fmoc-lys(dde)-oh，n末端的his使用的是boc-his(boc)-oh。

(6)lys定点胆酸化修饰

肽链合成完毕后，加入7ml2％水合肼/dmf选择性脱除胆酸化位点lys的dde保护基，dde保护基脱除后加入0.4mmol的fmoc-glu-otbu，0.4mmol的dic及0.44mmol的hobt，震荡反应2h。然后使用相同方法脱除fmoc后，加入0.4mmol的fmoc-6氨基己酸，0.4mmol的dic及0.44mmol的hobt缩合反应2h，反应完全后用7mldmf清洗树脂4次。再使用相同脱除fmoc保护基，加入0.4mmol的石胆酸，0.4mmol的dic及0.44mmol的hobt缩合反应2h，滤去反应液后用7mldmf清洗树脂4次。

(7)多肽的裂解

将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂reagentr(tfa/苯甲硫醚/苯酚/edt，90:5:3:2，v/v)5ml切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40ml冰乙醚，冷冻离心后粗品用15ml冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到粗肽。

(8)多肽的纯化

将目标多肽粗品溶于水中，浓度为10mg/ml，用0.25μm微孔滤膜过滤后进岛津制备型反相hplc系统纯化。色谱条件为c18反相制备柱(250mm×20mm，12μm)；流动相a：0.1％tfa/水(v/v)，流动相b：乙醇(v/v)；流速为15ml/min；检测波长为214nm。采用线性梯度(55％b～90％b/30min)洗脱，收集目标峰冻干得纯品。理论相对分子质量为4101.2。esi-msm/z:calu[m+3h]³⁺1368.0,[m+4h]⁴⁺1026.3；found[m+3h]³⁺1368.5,[m+4h]⁴⁺1026.7。

实施例2～6

根据实施例1所述的方法，根据相应的序列和侧链合成得到实施例2～6的xenglp-1类似物，通过esi-ms确证各自的分子量。

实施例2

理论相对分子质量为4185.3。esi-msm/z:calu[m+3h]³⁺1396.1,[m+4h]⁴⁺1047.3；found[m+3h]³⁺1396.8,[m+4h]⁴⁺1047.8。

实施例3

理论相对分子质量为4879.1。esi-msm/z:calu[m+3h]³⁺1627.4,[m+4h]⁴⁺1220.8；found[m+3h]³⁺1627.8,[m+4h]⁴⁺1221.2。

实施例4

理论相对分子质量为4963.2。esi-msm/z:calu[m+3h]³⁺1655.4,[m+4h]⁴⁺1241.8；found[m+3h]³⁺1655.9,[m+4h]⁴⁺1242.1。

实施例5

理论相对分子质量为5551.0。esi-msm/z:calu[m+3h]³⁺1851.3,[m+4h]⁴⁺1388.8；found[m+3h]³⁺1851.6,[m+4h]⁴⁺1389.3。

实施例6

理论相对分子质量为5635.1。esi-msm/z:calu[m+3h]³⁺1879.4,[m+4h]⁴⁺1409.8；found[m+3h]³⁺1879.6,[m+4h]⁴⁺1410.3。

实施例7

体外glp-1受体激动实验

将编码人glp-1受体的cdna克隆至载体pcdna3.0上，转染hek293细胞，得到能稳定表达人glp-1受体的hek293细胞。细胞在dmem-31053培养基中培养，实验2h前将hek293细胞重新悬浮于生长培养基中并接种在96孔板中。将liraglutide，semaglutide和seq.idno:2-7用dmso溶解后按照1pm-1000nm的浓度梯度稀释后加入96孔板中，然后在室温下孵育20分钟后使用camp试剂盒在envision2104酶标仪中测定生成的camp的量，分析数据，计算化合物的ec50值。如表1所示，所有xenglp-1类似物的受体激动活性都优于liraglutide和semaglutide，c末端经过修饰的xenglp-1类似物的受体激动活性高于c末端未经修饰的xenglp-1类似物。

表1liraglutide，semaglutide和xenglp-1类似物的体外活性

实施例8

xenglp-1类似物的体外血浆稳定性实验

大鼠眼球取血，血液装入含有肝素的离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清血浆作为温孵血浆，利用lc-ms来检测化合物的响应信号。100ul的liraglutide，semaglutide及seq.idno:2-7溶液与100ul的血浆，涡旋混合后置入37℃水浴中，温孵96小时，在0，12，24，48，72，96h时间点取10ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm离心，取上清液进lc-ms，计算各个时间点的峰面积，做出衰减曲线，计算半衰期。如图1所示，liraglutide和semaglutide的半衰期分别为16.9及41.0h，而所有的xenglp-1类似物的半衰期全部在72h以上，其中部分xenglp-1类似物的半衰期已经超过96h。

实施例9

xenglp-1类似物的长效降糖实验

8周龄db/db糖尿病模型小鼠，适应性饲养一周，血糖仪测定小鼠的血糖值高于20mmol/l后，随机分组，每组六只。分为阳性对照组liraglutide和semaglutide(25nmol/kg)，阴性对照组生理盐水，化合物组seq.idno:2-7(25nmol/kg)。小鼠自由饮水、饮食，0h给予化合物，在0，6，12，24，48，72h用血糖仪测定血糖，做出时间-血糖曲线。如图2所示，xenglp-1类似物的长效降糖活性显著的优于liraglutide和semaglutide，所有xenglp-1类似物的降糖时间都超过72h。

实施例10

xenglp-1类似物的降低体重实验

9周龄db/db糖尿病模型小鼠，适应性饲养一周，随机分组，每组6只。小鼠每天给予阳性对照liraglutide和semaglutide(25nmol/kg)，阴性对照生理盐水，给药组每天给予seq.idno:2-7(25nmol/kg)，治疗周期40天，每10天检测一次小鼠的体重。如图3所示，xenglp-1类似物能显著降低小鼠的体重，它们的体重减轻作用显著优于阳性对照liraglutide和semaglutide，表明了xenglp-1类似物具有良好的治疗糖尿病和减肥的药用前景。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>胆酸-非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1缀合肽及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

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<400>1

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202530

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35

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<223>第31位的xaa是proserserglyalaproproserlyslyslyslyslyslys-nh2

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hisglygluglythrtyrthrasnaspvalthrglutyrleugluglu

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3540