本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种新的噬菌体保护剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：病毒类生物制品多用于医药、农林业、养殖业等领域，对其细菌性病害进行免疫防治。该类生物制品在存放和运输过程中其活性受温度影响较大，如口蹄疫病毒在4℃较稳定，于-20℃特别是-50～-70℃下可存放数年，但于30℃下24h内即失活。因此需用适宜的病毒保护剂以防止病毒在不同保存条件时失活，延长病毒存放期，保持病毒效价。目前的保护剂按机制分为两大类：一类是渗透剂如dmso、甘油、蔗糖等，可渗入细胞内，降低因冷冻而增加的渗透压防止细胞内脱水，保护细胞因慢冻可能产生的破坏；另一类是非渗透剂如pvp、piccoll、蛋白质等，能防止细胞由外向内渗漏溶质，保护细胞在速冻和溶解时可能产生的损害。我国现阶段常用的生物制品的保护剂一般要求制品-15℃保存，2-8℃仅存3-6个月，常温下需尽快用完。但在运输不便、冷冻冷藏设施较差的环境下，易导致疫苗因运输或保存原因而效价降低甚至失效，从而致使免疫失败，疫病爆发，在阻碍畜牧业发展的同时，还造成了大量浪费和基金流失。因此、研制具有新新型的病毒类制品保护剂势在必行。噬菌体是一种通过结合细菌细胞表面特异位点以杀灭特异性细菌的病毒，主要化学成分为蛋白质和核酸，在地球上广泛存在。噬菌体具有较强的专一性及抑菌性，对耐药性细菌具有良好的防治作用，同时不易损伤微生物群落，因此自20世纪初以来陆续被制成抑菌生物制剂使用。目前噬菌体制剂通常以泼洒、喷涂、浇灌等方式使用，极少用于注射，由于其用量较大，其产品通常不采用冻干法进行保存，多以液体形式存放于2-8℃。但其同样有着在养殖地较偏远、运输及存储时条件差的情况下造成难以长期保持低温保存，从而致使噬菌体制剂失活的技术缺陷。因此研究开发在室温下保持活性的噬菌体制剂产品是非常有意义的和必要的，目前针对噬菌体产品保护剂的筛选以及对于室温条件下保护噬菌体活性的方法更是鲜见报道。研究开发新的噬菌体保护剂配方，寻找室温下可最大化保存噬菌体活性的保护剂是本
技术领域：
对于噬菌体产品工业生产及应用中急需解决的技术问题。技术实现要素：针对以上技术现状，本发明提供了一种新的噬菌体保护剂及其制备方法和应用，本发明保护剂降低了噬菌体制剂对温度保存条件的要求，提高并延长了噬菌体制剂活性。本发明保护剂由以重量百分含量计的以下组分组成：氯化钠0.8-2.2％、硫酸镁2-3％、氯化钙1-2.2％、组氨酸1-3％、明胶1.2-2.8％、乳糖4-8％、海藻糖4-6％和余量为水。作为实施方案之一，本发明所述保护剂由以重量百分含量计的以下组分组成：氯化钠1.5％、硫酸镁2.5％、氯化钙1.6％、组氨酸2％、明胶2％、乳糖6％、海藻糖5％，和余量为水。作为实施方案之一，本发明所述的水为去离子水。作为实施方案之一，本发明所述的噬菌体保护剂包括保护剂a液和保护剂b液；所述保护剂a液包括氯化钠、硫酸镁、氯化钙和明胶，作为实施方案之一，所述保护剂a液包括以重量百分含量计、氯化钠0.8-2.2％、硫酸镁2-3％、氯化钙1-2.2％和明胶1.2-2.8％；所述保护剂b液包括组氨酸、乳糖和海藻糖，作为实施方案之一，所述保护剂b液包括以重量百分含量计，组氨酸1-3％、乳糖4-8％和海藻糖4-6％。本发明还提供一种噬菌体保护剂的制备方法，所述方法包括：a.将上述以重量百分含量计的氯化钠、硫酸镁、氯化钙和明胶溶解于水中，121℃灭菌15min，4℃储存备用，即得保护剂a液；b.将上述以重量百分含量计的组氨酸、乳糖和海藻糖溶解于水中，经0.22μm滤膜过滤除菌后，4℃储存备用，即得保护剂b液；c.将保护剂a液与b液按体积比1:1混合均匀，得噬菌体保护剂。本发明还提供一种噬菌体制剂，所述制剂包括本发明保护剂和噬菌体，其中所述噬菌体和保护剂的体积比为1：1。本发明还提供一种噬菌体制剂的制备方法，所述方法包括：在无菌条件下，将保护剂加入噬菌体制剂中，按1:1体积比混合均匀，得到具有保护剂的噬菌体制剂。本发明噬菌体保护剂可以适用于不同类型的噬菌体，例如包括但不限于副溶血性弧菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体或葡萄球菌噬菌体；作为实施方案之一，所述葡萄球菌噬菌体包括但不限于为金黄色葡萄球菌噬菌体。作为实施方案之一，所述副溶血性弧菌噬菌体包括但不限于副溶血性弧菌噬菌体vp46、vp48或vp7。所述副溶血性弧菌噬菌体vp46(vibrioparahaemolyticusphagevp46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为cctccno：m2016290；所述副溶血性弧菌噬菌体vp48(vibrioparahaemolyticusphagevp48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为cctccno：m2016291；所述副溶血性弧菌噬菌体vp7(vibrioparahaemolyticusphagevp7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为cctccno：m2016289。制备本发明所述副溶血性弧菌噬菌体vp46、vp48及vp7的tsb液体培养基的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，ph7.0。所述tsb(2％nacl)培养液的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠20g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，ph7.0。所述tsa固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白酶消化物5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph7.0。半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂7g，蒸馏水1000ml，ph7.0。sm液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/ltrishcl50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。制备本发明所述副溶血性弧菌噬菌体vp46、vp48及vp7的分离纯化包括：分别采集福建海产品样本及墨西哥海水样本各50ml，5000rpm离心10min后取20ml上清液并除菌，将其与20ml2倍tsb液体培养基及2ml处于对数期的携带pira、pirb基因的副溶血性弧菌菌液(108cfu/ml)均匀混合，于30℃下150r过夜摇培，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液50μl与其宿主携带pira、pirb基因的副溶血性弧菌菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的tsa平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mlsm液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mltsb液体培养基中，加入0.1ml携带pira、pirb基因的副溶血性弧菌菌液并混匀，30℃下150r过夜摇培，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。自福建海产品样本中共分离得到2株携带pira、pirb基因的副溶血性弧菌噬菌体，其分别为副溶血性弧菌噬菌体vp46、副溶血性弧菌噬菌体vp48；自墨西哥海水样本中共分离得到1株携带pira、pirb基因的副溶血性弧菌噬菌体，为副溶血性弧菌噬菌体vp7。作为实施方案之一，本发明所述茄科雷尔氏菌噬菌体包括但不限于茄科雷尔氏菌噬菌体gp1(ralstoniasolanacearumphagegp1)、茄科雷尔氏菌噬菌体gp2(ralstoniasolanacearumphagegp2)、或茄科雷尔氏菌噬菌体gp3(ralstoniasolanacearumphagegp3)，其中所述茄科雷尔氏菌噬菌体gp1(ralstoniasolanacearumphagegp1)、保藏编号为cctccno:m2016633，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2016年11月10日；所述茄科雷尔氏菌噬菌体gp2(ralstoniasolanacearumphagegp2)、保藏编号为cctccno:m2016634，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2016年11月10日；所述茄科雷尔氏菌噬菌体gp3(ralstoniasolanacearumphagegp3)、保藏编号为cctccno：m2016635，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2016年11月10日；制备本发明以上所述茄科雷尔氏菌噬菌体的tsb液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml；tsa固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml；tsb半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000ml；sm液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/ltrishcl50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。本发明所述茄科雷尔氏菌噬菌体gp1(ralstoniasolanacearumphagegp1)、茄科雷尔氏菌噬菌体gp2(ralstoniasolanacearumphagegp2)、或茄科雷尔氏菌噬菌体gp3(ralstoniasolanacearumphagegp3)，噬菌体的分离，纯化包括：样品前处理：分别取来源于山东省安丘市，安徽省阜阳市和四川省崇州市的姜田土样各30g，浸泡于100ml灭菌的0.9％nacl中，4℃冰箱中过夜静置后室温条件下4000rpm离心取上清液备用。噬菌体的分离：分别从上述3份材料中取20ml上清液，用0.22μm滤膜过滤，加入至20ml2×tsb液体培养基中。向含有来源于山东省安丘市的材料中加入200μl处于对数期的茄科雷尔氏菌“3-2-1”(来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌，由四川农业大学提供)菌液，向含有来源于安徽省阜阳市的材料中加入200μl处于对数期的茄科雷尔氏菌“5-2-2”(来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌，由四川农业大学提供)菌液，向含有来源于四川省崇州市的材料中加入200μl处于对数期的茄科雷尔氏菌“zk15-2”(来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌，由四川农业大学提供)菌液，分别置于30℃摇床中200rpm过夜摇培。吸取2ml培养物，用0.22μm滤膜过滤上清液，备用。取处于对数期的代号分别为“3-2-1”，“5-2-2”和“zk15-2”的姜瘟病来源的茄科雷尔氏菌分别加入到半固体tsb培养基中混匀，倾倒于tsa平板上，制备成分别含有“3-2-1”，“5-2-2”和“zk15-2”的双层平板。将用茄科雷尔氏菌“3-2-1”富集的过滤后的上清液，点滴于含有“3-2-1”的已凝固的双层平板上；将用茄科雷尔氏菌“5-2-2”富集的过滤后的上清液，点滴于含有“5-2-2”的已凝固的双层平板上；将用茄科雷尔氏菌“zk15-2”富集的过滤后的上清液，点滴于含有“zk15-2”的已凝固的双层平板上。在无菌条件下风干后，放置于30℃培养24h，形成噬菌体点滴斑。噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mlsm缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取102,104和106稀释液分别加入对数期宿主菌0.5ml，混合均匀静置15min后，加入5ml,40℃半固体tsb培养基,立刻倾倒于tsa平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于30℃温箱培养16h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mlsm缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1ml对数期宿主菌菌液的50mltsb培养基中，30℃条件下180rpm摇培16h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液。分别将获得的3株茄科雷尔氏菌噬菌体命名为茄科雷尔氏菌噬菌体gp1(ralstoniasolanacearumphagegp1)(宿主为来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌“3-2-1”，由四川农业大学提供。)(简称“噬菌体gp1”或“gp1”),茄科雷尔氏菌噬菌体gp2(ralstoniasolanacearumphagegp2)(宿主为来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌“5-2-2”，由四川农业大学提供。)(简称“噬菌体gp2”或“gp2”),茄科雷尔氏菌噬菌体gp3(ralstoniasolanacearumphagegp3)(宿主为来源于姜瘟病的茄科雷尔氏菌“zk15-2”，由四川农业大学提供。)。作为实施方案之一，本发明所述金黄色葡萄球菌噬菌体包括但不限于短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)或短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)，或短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)；所述短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号cctccno：m2015142；所述金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号cctccno:m2016535；所述短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号cctccno：m2015143；短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号cctccno：m2015144。制备以上所述金黄色葡萄球菌噬菌体所用的tsb液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml；tsa固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml；tsb半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000ml；sm液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/ltrishcl50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。本发明所述短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)或短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)，或短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)的分离制备及纯化培养包括：所述短尾噬菌体bp-13，金黄色葡萄球菌bp-13a,短尾噬菌体bp-14以及短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39的来源样品采集于加拿大蒙特利尔污水处理厂，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。噬菌体的分离：取10ml过滤后上清液，加入10ml2倍tsb培养基中，同时加入1ml噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养16h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min,用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5ml噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5ml，40℃半固体tsb培养基中混匀，倾倒于tsa平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mlsm缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取102,104和106稀释液分别加入对数期宿主菌0.5ml，混合均匀静置15min后，加入5ml,40℃半固体tsb培养基,立刻倾倒于tsa平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养16h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mlsm缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1ml对数期宿主菌菌液的50mltsb培养基中，37℃条件下180rpm摇培16h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、保藏编号为cctccno：m2015142，金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)、保藏编号为cctccno：m2016535，短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)、保藏编号为cctccno：m2015143，或短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)、保藏编号为cctccno：m2015144。作为实施方案之一，本发明所述金黄色葡萄球菌噬菌体包括但不限于金黄色葡萄球菌噬菌体j1p1，j1p2，j1p3，j2-1p1或j2-1p2，其中，所述金黄色葡萄球菌噬菌体j1p1(staphylococcusaureusphagej1p1)、保藏编号为cctccno：m2016284，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2016年5月26日；金黄色葡萄球菌噬菌体j1p2(staphylococcusaureusphagej1p2)、保藏编号为cctccno：m2016285,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2016年5月26日；金黄色葡萄球菌噬菌体j1p3(staphylococcusaureusphagej1p3)、保藏编号为cctccno：m2016286，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2016年5月26日；金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p1(staphylococcusaureusphagej2-1p1)、保藏编号为cctccno：m2016287，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2016年5月26日；金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p2(staphylococcusaureusphagej2-1p2)、保藏编号为cctccno：m2016288，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2016年5月26日；制备以上所述金黄色葡萄球菌噬菌体的lb液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml；lb固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml；半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂7g，蒸馏水1000ml；sm液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/ltrishcl50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。本发明所述噬菌体j1p1，j1p2，j1p3，j2-1p1和j2-1p2的分离制备及纯化培养包括如下：所述噬菌体j1p1，j1p2，j1p3，j2-1p1和j2-1p2的来源样品采集于江苏省南京市江宁区江南奶牛场堆积1昼夜的牛粪中，经0.9％nacl溶液解吸附24h后，低速常温离心取上清液，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。噬菌体的分离：取10ml过滤后上清液，加入10ml2倍tsb培养基中，同时加入1ml噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养16h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min,用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5ml噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5ml，40℃半固体tsb培养基中混匀，倾倒于tsa平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10ul，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mlsm缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取102,104和106稀释液分别加入对数期宿主菌0.5ml，混合均匀静置15min后，加入5ml,40℃半固体tsb培养基,立刻倾倒于tsa平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养16h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mlsm缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1ml对数期宿主菌菌液的50mltsb培养基中，37℃条件下180rpm摇培16h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到金黄色葡萄球菌噬菌体为金黄色葡萄球菌噬菌体j1p1(staphylococcusaureusphagej1p1)、保藏编号为cctccno：m2016284，金黄色葡萄球菌噬菌体j1p2(staphylococcusaureusphagej1p2)、保藏编号为cctccno：m2016285,金黄色葡萄球菌噬菌体j1p3(staphylococcusaureusphagej1p3)、保藏编号为cctccno：m2016286，金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p1(staphylococcusaureusphagej2-1p1)、保藏编号为cctccno：m2016287，金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p2(staphylococcusaureusphagej2-1p2)、保藏编号为cctccno：m2016288。本发明具有下列优点和效果：采用液体保护剂代替传统的冻干保护剂，省去冷冻干燥过程，降低生产成本及技术复杂性；经37℃热加速实验证实噬菌体在新保护剂中37℃下168h后仍保持较高活性，其效价为旧保护剂配方处理的5-12倍；4℃下96周内噬菌体在新保护剂中其效价数量级稳定不变；25℃下36周内噬菌体在新保护剂中其效价数量级不变；30℃下32周内噬菌体在新保护剂中其效价数量级不变；新保护剂在热加速环境及室温下均对噬菌体具有良好的持续保护作用，可使噬菌体维持更长时间活性及其对宿主菌的裂解能力，极大地降低运输及仓储过程的成本。具体实施方式以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属
技术领域：
普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名是本领域公知的或常用的，若未特别指明，本发明实施例中所用的保护剂试剂均可市售获得。以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号并进行了相应的保藏。以下实施例中，使用的试剂如下：氯化钠为市购产品，纯度大于等于99.5％，分子式nacl，分子量为58.44。硫酸镁为市购产品，纯度大于等于99.5％，分子式mgso4·7h2o，分子量为246.47。氯化钙为市购产品，纯度大于等于99.5％，分子式cacl2，分子量为147.02。组氨酸为市购l-组氨酸，纯度大于等于99.0％。明胶为市购产品，纯度大于等于99.0％。乳糖为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式c12h22o11，分子量为342.3。海藻糖为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式c12h22o11·2h2o，分子量为378.3。实施例1噬菌体保护剂的制备准确称取氯化钠8g、硫酸镁20g、氯化钙10g、明胶12g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至500ml；121℃条件下灭菌15min，得到噬菌体保护剂a液，4℃储存备用。准确称取组氨酸10g、乳糖40g、海藻糖40g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至500ml；经过0.22μm滤膜过滤除菌后制成b液，得到噬菌体保护剂b液，4℃储存备用。在无菌条件下，将噬菌体保护剂a液与b液按1:1体积比混合均匀，得到噬菌体保护剂。实施例2噬菌体保护剂的制备准确称取氯化钠22g、硫酸镁30g、氯化钙22g、明胶28g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至500ml；121℃条件下灭菌15min，得到噬菌体保护剂a液，4℃储存备用。准确称取组氨酸30g、乳糖80g、海藻糖60g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至500ml；经过0.22μm滤膜过滤除菌后制成b液，得到噬菌体保护剂b液，4℃储存备用。在无菌条件下，将噬菌体保护剂a液与b液按1:1体积比混合均匀，得到噬菌体保护剂。实施例3噬菌体保护剂的制备准确称取氯化钠15g、硫酸镁25g、氯化钙16g、明胶20g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至500ml；121℃条件下灭菌15min，得到噬菌体保护剂a液，4℃储存备用。准确称取组氨酸20g、乳糖60g、海藻糖50g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至500ml；经过0.22μm滤膜过滤除菌后制成b液，得到噬菌体保护剂b液，4℃储存备用。在无菌条件下，将噬菌体保护剂a液与b液按1:1体积比混合均匀，得到噬菌体保护剂。实施例4噬菌体保护剂的制备(对比保护剂)准确称取氯化钠8.5g、硫酸镁2g、1mol/ltrishcl50ml、明胶0.25g，加入适量去离子水搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1l；121℃条件下灭菌15min，冷却至室温，得到噬菌体保护剂。实施例5副溶血性弧菌噬菌体制剂的制备取副溶血性弧菌噬菌体vp46(vibrioparahaemolyticusphagevp46)，保藏编号cctccno：m2016290；副溶血性弧菌噬菌体vp48(vibrioparahaemolyticusphagevp48)，保藏编号cctccno：m2016291；副溶血性弧菌噬菌体vp7(vibrioparahaemolyticusphagevp7)，保藏编号cctccno：m2016289按比例为1:1:1制成的噬菌体鸡尾酒组合。在无菌条件下，将实施例1制备的噬菌体保护剂加入3株副溶血性弧菌噬菌体的鸡尾酒组合中并混合均匀，其中保护剂与鸡尾酒组合的体积比为1：1，得到具有保护剂的副溶血性弧菌噬菌体鸡尾酒组合的制剂。将实施例2-4中制备得到的噬菌体保护剂按照实施例5所述方法，同样制备得到具有保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂。实施例6茄科雷尔氏菌噬菌体制剂的制备取茄科雷尔氏菌噬菌体gp1(ralstoniasolanacearumphagegp1)，保藏编号cctccno：m2016633；茄科雷尔氏菌噬菌体gp2(ralstoniasolanacearumphagegp2)，保藏编号cctccno：m2016634；茄科雷尔氏菌噬菌体gp3(ralstoniasolanacearumphagegp3)，保藏编号cctccno：m2016635。在无菌条件下，将实施例1中制备得到的噬菌体保护剂分别加入3株茄科雷尔氏菌噬菌体制剂中，以体积比1:1混合均匀，最后分别得到含有保护剂的茄科雷尔氏菌噬菌体gp1的制剂、茄科雷尔氏菌噬菌体gp2的制剂和茄科雷尔氏菌噬菌体gp3的制剂。将实施例2-4中制备得到的噬菌体保护剂按照实施例5所述方法，同样制备得到具有保护剂的茄科雷尔氏菌噬菌体制剂。实施例7葡萄球菌噬菌体制剂的制备取短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、保藏编号为cctccno：m2015142；金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)、保藏编号为cctccm2016535；短尾噬菌体bp-14(5podoviridaesp.bp-14)、保藏编号为cctccno：m2015143；短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)、保藏编号为cctccno：m2015144。金黄色葡萄球菌噬菌体j1p1(staphylococcusaureusphagej1p1)、保藏编号为cctccno：m2016284；金黄色葡萄球菌噬菌体j1p2(staphylococcusaureusphagej1p2)、保藏编号为cctccno：m2016285；金黄色葡萄球菌噬菌体j1p3(staphylococcusaureusphagej1p3)、保藏编号为cctccno：m2016286；金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p1(staphylococcusaureusphagej2-1p1)、保藏编号为cctccno：m2016287；金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p2(staphylococcusaureusphagej2-1p2)、保藏编号为cctccno：m2016288。在无菌条件下，将实施例1中制备得到的噬菌体保护剂分别加入上述9株金黄色葡萄球菌噬菌体的制剂中，以体积比1:1混合均匀，最后分别得到含有保护剂的短尾噬菌体bp-13的制剂、金黄色葡萄球菌bp-13a的制剂、短尾噬菌体bp-14的制剂、短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39的制剂、金黄色葡萄球菌噬菌体j1p1的制剂、金黄色葡萄球菌噬菌体j1p2的制剂、金黄色葡萄球菌噬菌体j1p3的制剂、金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p1的制剂和金黄色葡萄球菌噬菌体j2-1p2的制剂。将实施例2-4中制备得到的噬菌体保护剂按照实施例5所述方法，同样制备得到具有保护剂的葡萄球菌噬菌体制剂。实验例1噬菌体保护剂组分的初筛选取18种常见保护剂成分分别进行单因素实验：按表1浓度进行配制并除菌，另设不添加保护剂的对照组1组，共19组；其中1-18组各保护剂百分比均为g/100ml，余量为去离子水。各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂制备方法同实施例5。表118种噬菌体保护剂组分浓度及其除菌方法将以上各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂置于37℃下进行恒温加速实验，每24h测定其效价，观察各保护剂组分效果。结果如表2所示，37℃下恒温加速24h后，peg-8000、聚乙烯吡咯烷酮及二甲基亚砜中4种噬菌体制剂效价均已低于104pfu/ml，保护剂中不可选用该三种组分；48h后4％牛血清蛋白、氯仿、5％山梨醇及5％peg-4000中4种噬菌体制剂效价下降5-100倍不等，保护剂中排除该4种组分；72h后除vp7制剂外，0.5％乳清蛋白中其余3种噬菌体制剂效价均下降约2-4倍，去除该组分。37℃下恒温加速72h后噬菌体-保护剂组分中最终效价与初始效价相近的为：2.2％氯化钠、3％硫酸镁、2.2％氯化钙、3％组氨酸、2.8％明胶、10％脱脂奶粉、6％海藻糖、8％乳糖、4％蛋白胨；但由于10％脱脂奶粉可增加噬菌体制剂粘稠度，不利于生产中后续处理，同时4％蛋白胨可能增加噬菌体制剂受污染变质风险，故不选择10％脱脂奶粉与4％蛋白胨两种组分。综上，噬菌体保护剂初筛组分为：2.2％氯化钠、3％硫酸镁、2.2％氯化钙、3％组氨酸、2.8％明胶、6％海藻糖、8％乳糖。表237℃下副溶血性弧菌噬菌体于不同保护剂中效价a.vp46于不同保护剂中的效价(pfu/ml)b.vp48于不同保护剂中的效价(pfu/ml)c.vp7于不同保护剂中的效价(pfu/ml)d.鸡尾酒组合(cocktail)(vp46：vp48：vp47＝1:1:1)于不同保护剂中的效价(pfu/ml)保护剂组分0h24h48h72h去离子水2.1x1092.1x1091.5x1097.5x1084％牛血清蛋白2.1x1091.2x1094.0x1089.0x107氯仿2.1x1099.6x1071.4x1084.0x1075％山梨醇2.1x1098.0x1084.0x1081.0x1082.2％氯化钠2.1x1091.6x1091.7x1091.3x1093％硫酸镁2.1x1091.5x1091.6x1091.8x1092.2％氯化钙2.1x1091.9x1091.3x1091.2x1093％组氨酸2.1x1091.6x1091.6x1091.7x1092.8％明胶2.1x1091.8x1091.4x1091.6x10910％脱脂奶粉2.1x1092.5x1091.6x1091.3x1096％海藻糖2.1x1091.6x1099.8x1087.7x1088％乳糖2.1x1092.0x1091.7x1091.9x1094％蛋白胨2.1x1092.0x1091.3x1091.3x1095％peg-40002.1x1095.6x107<107<1055％peg-80002.1x109<104<104<104聚乙烯吡咯烷酮2.1x109<104<104<104二甲基亚砜2.1x109<104<104<1040.5％乳清蛋白2.1x1096.0x1081.2x1096.6x108对照2.1x1092.1x1091.3x1096.9x108实验例2噬菌体保护剂组分工作浓度优化选取实验例1中最终获得的保护剂组分，按表3所示组分配制保护剂，余量为去离子水，另设对照1组，其灭菌方法参照表1。各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂制备方法同实施例5。表3噬菌体保护剂组分浓度(g/100ml)将以上各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂置于37℃下进行恒温加速实验，每24h测定其效价，观察各保护剂不同浓度下效果。结果显示，在0-72h间7种保护剂中噬菌体效价均无太大变化，至96h起效价开始下降；其中vp46在7种保护剂中效价约降低3-5倍，其对照组下降约20倍；vp48下降约4-9倍，其对照组下降约15倍；vp7下降约4-6倍，其对照组下降约20倍；cocktail下降约5-7倍，对照则下降约30倍(表4)；说明7种保护剂在3种浓度下均对噬菌体具有良好的保护作用。结合表4恒温加速实验结果及保护剂成本两方面，可得优选后各保护剂浓度：氯化钠1.5％、硫酸镁2.5％、氯化钙1.6％、组氨酸2％、明胶2％、乳糖6％、海藻糖5％，余量为去离子水。综合上述保护剂成分及其浓度后得实施例1-3中所述综合性保护剂配方。表437℃下副溶血性弧菌噬菌体于不同浓度保护剂中效价a.vp46于不同浓度保护剂中的效价(pfu/ml)b.vp48于不同浓度保护剂中的效价(pfu/ml)c.vp7于不同浓度保护剂中的效价(pfu/ml)d.鸡尾酒组合(cocktail)(vp46：vp48：vp47＝1:1:1)于不同浓度保护剂中的效价(pfu/ml)实验例3综合性保护剂中噬菌体的恒温加速稳定性试验分别按照实施例1、实施例2、实施例3、实施例4所述方法配制噬菌体保护剂，依实施例5所述方法分别制备各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂；其中实施例4中所述保护剂配方为对比保护剂(又称“旧保护剂”)。将以上各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂置于37℃下进行恒温加速实验，同时以副溶血性弧菌噬菌体原始制剂为对照，每24h测定其效价，对比新旧保护剂效价稳定性。试验结果如表5所示：4种噬菌体制剂在3种新保护剂(实施例1-3)中前96h效价数量级未发生变化，对照效价较初始效价下降10-20倍不等；120h时各噬菌体保护剂处理效价约为初始效价的一半。168h时vp46与vp48保护剂处理最低效价均为初始效价的10％，其最高效价均为初始效价的25％；vp7保护剂处理最低效价为初始效价的19％，其最高效价为初始效价的26％；cocktail保护剂处理最低效价为初始效价的20％，其最高效价为初始效价的32％。较实施例1-3相比，旧保护剂配方(实施例4)中噬菌体在72h时其效价已降为初始效价的50％，后续时间中各噬菌体效价以较大幅度持续下降，仅高于对照效价；vp46与vp48对照较初始效价下降2个数量级，vp7与cocktail对照则较其初始效价降低3个数量级。上述结果说明，3种新保护剂可使噬菌体在37℃下168h后仍保持较高活性，其效价为旧保护剂配方处理的5-12倍；其中实施例3处理的噬菌体效价较实施例1与实施例2相比较高，因此将实施例3保护剂配方作为综合性保护剂优选配方。表537℃下副溶血性弧菌噬菌体于综合性保护剂中效价a.vp46于综合性保护剂中的效价(pfu/ml)b.vp48于综合性保护剂中的效价(pfu/ml)保护剂0h24h48h72h96h120h144h168h实施例19.0x1088.9x1088.6x1088.8x1086.0x1085.3x1082.0x1089.3x107实施例29.0x1088.7x1088.5x1088.0x1087.5x1084.0x1082.1x1081.0x108实施例39.0x1089.0x1088.8x1088.3x1087.0x1085.0x1083.1x1082.3x108实施例49.0x1086.5x1085.6x1085.0x1081.0x1086.1x1073.0x1071.8x107对照9.0x1085.1x1084.6x1082.9x1085.9x1073.4x1071.2x1079.1x106c.vp7于综合性保护剂中的效价(pfu/ml)保护剂0h24h48h72h96h120h144h168h实施例12.8x1092.6x1092.0x1092.1x1091.9x1091.0x1098.6x1085.3x108实施例22.8x1092.4x1092.3x1092.1x1091.8x1091.6x1091.0x1096.6x108实施例32.8x1092.7x1092.5x1092.2x1091.9x1091.5x1091.1x1097.3x108实施例42.8x1092.2x1091.8x1091.6x1099.2x1087.1x1084.3x1081.0x108对照2.8x1092.6x1098.5x1086.3x1081.2x1085.8x1074.0x1063.0x106d.鸡尾酒组合(cocktail)(vp46：vp48：vp47＝1:1:1)于综合性保护剂中的效价(pfu/ml)保护剂0h24h48h72h96h120h144h168h实施例12.1x1092.0x1091.7x1091.4x1091.0x1098.3x1087.4x1084.3x108实施例22.1x1091.9x1091.8x1091.6x1091.2x1099.6x1088.0x1085.6x108实施例32.1x1091.8x1091.8x1091.7x1091.5x1091.0x1099.2x1086.7x108实施例42.1x1091.6x1091.6x1091.3x1099.4x1086.6x1082.7x1088.0x107对照2.1x1092.1x1091.3x1096.9x1089.5x1073.1x1079.0x1065.6x106实验例4本发明保护剂中噬菌体的温度稳定性试验按照实施例3所述方法配制噬菌体本发明保护剂(以下简称“新保护剂”)，按照实施例4所述方法配制噬菌体对比保护剂(又称“旧保护剂”)，依实施例5所述方法分别制备各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂。将以上各组具保护剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂分别置于2-8℃、25℃及30℃下进行存活稳定性实验，其中以实施例4处理的副溶血性弧菌噬菌体制剂为对照，每4周测定其效价，观察各处理效价。结果如表6所示，旧保护剂中vp464℃下效价于20周起降至109pfu/ml，此后至96周均稳定在该数量级；25℃下16周起效价降低一半，32周时效价降至108pfu/ml，68周后失活；30℃下4周起效价降至109pfu/ml，28周时效价下降1000倍，60周后失活。新保护剂中vp464℃下效价稳定，直至96周仍维持在1010pfu/ml；25℃下32周时vp46效价仍稳定在1010pfu/ml，直至36周起效价数量级开始下降，96周时仍具107pfu/ml效价；30℃下28周时vp46效价仍为1010pfu/ml，自32周起效价数量级开始下降，96周时效价为106pfu/ml。噬菌体vp48、vp7及cocktail在两种保护剂中的效价具有同vp46相近的变化趋势。说明新保护剂可良好地维持副溶血性弧菌噬菌体的存活稳定性及其对宿主菌的裂解能力，同时可使副溶血性弧菌噬菌体制剂在室温下具有较长的存放时间，利于噬菌体制剂的生产及应用。表6不同温度下副溶血性弧菌噬菌体于新保护剂中效价a.vp46于新保护剂中的效价(pfu/ml)b.vp48于新保护剂中的效价(pfu/ml)c.vp7于新保护剂中的效价(pfu/ml)d.鸡尾酒组合(cocktail)(vp46：vp48：vp47＝1:1:1)新保护剂中的效价(pfu/ml)实验例5本发明保护剂中噬菌体的恒温加速稳定性试验按照实施例3所述方法配制的本发明噬菌体保护剂(下表a～i这种称“新保护剂”)，按照实施例4所述方法配制的噬菌体对比保护剂(以下表a～i中称“旧保护剂”)，依实施例6与实施例7所述方法分别制备各组具保护剂的茄科雷尔氏菌噬菌体制剂与葡萄球菌噬菌体制剂。将以上各组具保护剂的茄科雷尔氏菌噬菌体制剂与葡萄球菌噬菌体制剂置于40℃下进行恒温加速实验，同时以实施例4处理的茄科雷尔氏菌噬菌体制剂与葡萄球菌噬菌体制剂为对照，每3天测定其效价，对比新旧保护剂效价稳定性。结果如表7、表8所示，40℃下新保护剂中茄科雷尔氏菌噬菌体制剂与葡萄球菌噬菌体制剂于第9天效价数量级开始下降，且后续时间中效价降低缓慢，直至30天时仍具有105-104pfu/ml的效价；12株噬菌体在旧保护剂中于第3天起效价数量级开始下降，且后续时间中效价下降迅速，第15天时仅效价具104pfu/ml，第18天时已失去活性。说明较旧保护剂相比，新保护剂对茄科雷尔氏菌噬菌体与葡萄球菌噬菌体活性及其裂解能力均具有更为良好的保护作用。表740℃下茄科雷尔氏菌噬菌体于保护剂中的效价a.gp1于保护剂中的效价(pfu/ml)b.gp2于保护剂中的效价(pfu/ml)c.gp3于保护剂中的效价(pfu/ml)表840℃下葡萄球菌噬菌体于保护剂中的效价a.j1p1于保护剂中的效价(pfu/ml)b.j1p2于保护剂中的效价(pfu/ml)c.j1p3于保护剂中的效价(pfu/ml)d.j2-1p1于保护剂中的效价(pfu/ml)e.j2-1p2于保护剂中的效价(pfu/ml)f.bp-13于保护剂中的效价(pfu/ml)g.bp-13a于保护剂中的效价(pfu/ml)h.bp-14于保护剂中的效价(pfu/ml)i.bp-39于保护剂中的效价(pfu/ml)当前第1页12