一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种鸽痘病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术：

鸽痘(pigeonpox，pox)是由鸽痘病毒引起的鸽的病毒性传染病。临床分为皮肤型和黏膜型，本病毒主要通过皮肤或粘膜的伤口侵入体内，传染媒介是某些吸血昆虫尤其是蚊子。其特征是体表无羽毛部位皮肤出现散在的、结节状的痘疹(皮肤型)，或上呼吸道、嚎角、口腔、咽喉和食道茹膜出现形成一层黄白色干酪样伪膜(黏膜型)，因而影响运动、吞咽、呼吸，极易造成患病鸽因饥饿或窒息而死亡。

pcr技术在动物疫病快速诊断中得到了广泛应用，目前尚未有诊断鸽痘病毒的pcr诊断试剂盒，临床上无法快速诊断出鸽痘病毒，检测周期长、成本高。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸽痘病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸽痘病毒感染提供有力的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种鸽痘病毒pcr诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为dnaisoreagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、pcrbuffer、dntp、pox-f上游引物、pox-r下游引物和rtaqdna聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽痘病毒阳性质粒。

优选的，所述pox-f上游引物的序列为：5’-gactctagtctacaccactgcct-3’；所述pox-r下游引物的序列为：5’-aaaataatggaactacatagta-3’。

优选的，所述裂解液的成分为dnaisoreagent，20个反应共计20ml，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×pcrbuffer、2.5mmol·l^-1dntp、25μmol·l^-1pox-f上游引物、25μmol·l^-1pox-r下游引物和5u/μlrtaqdna聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μl，20个反应共计460μl，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0ml，装成1瓶；所述阳性对照为鸽痘病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μl，装成1管。

(二)一种鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1，dna提取

子步骤1.1，待检样品dna提取：吸取待检样品置入无菌离心管(ep管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用naoh溶解，得待检样品dna提取液；

子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用naoh溶解，得阴性对照样品提取液；

步骤2，pcr扩增反应

子步骤2.1，待检样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品dna提取液，混合均匀，进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品pcr扩增产物；

子步骤2.2，阴性对照样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品pcr扩增产物；

子步骤2.3，阳性对照样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液，加入鸽痘病毒阳性质粒，混合均匀，进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品pcr扩增产物；

步骤3，电泳检测

通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品pcr扩增产物、阴性对照样品pcr扩增产物和阳性对照样品pcr扩增产物进行电泳检测，并进行判断。

优选的，子步骤1.1中，所述待检样品为组织病料样品、血清样品或喉头棉拭子样品。

优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、pcrbuffer、dntp、pox-f上游引物、pox-r下游引物和rtaqdna聚合酶。

进一步优选的，所述pox-f上游引物的序列为：5’-gactctagtctacaccactgcct-3’；所述pox-r下游引物的序列为：5’-aaaataatggaactacatagta-3’。

优选的，步骤2中，所述多个循环为35个循环。

优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出766bp条带，说明对照成立；待检样品pcr扩增产物中出现766bp条带，即为鸽痘病毒感染；待检样品pcr扩增产物为无条带者，即为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒采用pcr扩增，快速、特异性检测出鸽痘病毒，为临床控制鸽痘病毒感染提供有力的技术手段；检测总时间控制在2.5小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决鸽痘病毒引起的感染的诊断问题，适合鸽场快速检测，亦适用于流行病学调查。

本发明的提供了针对鸽痘病毒的特异性引物，pox-f/pox-r为鸽痘特异性扩增引物组；利用其制成的试剂盒能快速、特异的检测出鸽痘病毒，鸽痘出现766bp条带。

本发明的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒能检测的极限为1.0×10^-8pg·μl^-1，表明本发明的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测方法有很高的灵敏度，本发明的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。

本发明提供的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明鸽痘病毒pcr诊断试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒实用性和适用性良好。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为本发明鸽痘病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法特异性试验电泳图；

图中m为dl2000dna分子质量标准，1为鸽疱疹病毒，2为鸽衣原体，3为传染性喉气管炎病毒，4为鸽痘病毒，5为鸽腺病毒，6为鸽支原体；

图2为本发明鸽痘病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法灵敏度试验电泳图；

图中m为dl2000dna分子质量标准，1-10为鸽痘病毒样品dna梯度稀释，浓度范围为1.0×10^-1pg·μl^-1～1.0×10^-10pg·μl^-1；

图3为本发明鸽痘病毒pcr诊断试剂盒对部分临床样品电泳检测结果；

图中m为dl2000dna分子质量标准，1为阴性对照，2为阳性对照，3-9为部分组织病料、血清和喉头棉拭子样品的电泳检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1

一种鸽痘病毒pcr诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，具体如下：

1)裂解液：成分为dnaisoreagent，20个反应共计20ml，装成1瓶；

2)扩增反应混合液：由灭菌三蒸水、10×pcrbuffer、2.5mmol·l^-1dntp、25μmol·l^-1pox-f上游引物、25μmol·l^-1pox-r下游引物和5u/μlrtaqdna聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μl，20个反应共计460μl，装成1管；其中引物的设计与制备如下：

参考genbank上公布的鸽痘病毒基因组序列，经过综合分析比对，针对鸽痘病原基因设计了2条引物，引物的序列如下：

pox-f上游引物的序列为：5’-gactctagtctacaccactgcct-3’；

pox-r下游引物的序列为：5’-aaaataatggaactacatagta-3’；

上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；

3)阴性对照：为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0ml，装成1瓶；

4)阳性对照：为鸽痘阳性质粒，20个反应共计40.0μl，装成1管。

本发明的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒中裂解液为常温保存，扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照保存条件为-20℃。

上述鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1，dna提取

子步骤1.1，待检样品dna提取：吸取100μl待检样品置入1.5ml无菌ep管，加入800μl裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μl冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，在4℃下以12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置ep管，在空气中自然干燥，用40μl8mmol·l^-1naoh溶解，得待检样品dna提取液；

子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取100μl灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μl裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μl冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，在4℃下以12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置ep管，在空气中自然干燥，用40μl8mmol·l^-1naoh溶解，得阴性对照样品提取液；

步骤2，pcr扩增反应

子步骤2.1，待检样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液23μl，加入待检样品dna提取液2μl，混合均匀，进行pcr扩增反应，pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品pcr扩增产物；

子步骤2.2，阴性对照样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液23μl，加入阴性对照样品提取液2μl，混合均匀，进行pcr扩增反应，pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品pcr扩增产物；

子步骤2.3，阳性对照样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液23μl，加入鸽痘病毒阳性质粒2μl，混合均匀，进行pcr扩增反应，pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品pcr扩增产物；

步骤3，电泳检测

通过经10g·l^-1琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品pcr扩增产物、阴性对照样品pcr扩增产物和阳性对照样品pcr扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出766bp条带，说明对照成立；待检样品pcr扩增产物中出现766bp条带，即为鸽痘病毒感染；待检样品pcr扩增产物为无条带者，即为阴性。

对实施例1所得的一种鸽痘病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法的特异性、稳定性、灵敏性进行试验，并通过田间试验对本发明所得鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的实用性和适用性进行验证，具体如下：

(1)异性试验

采用实施例1所得的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测方法提取鸽痘病毒、鸽腺病毒、传染性喉气管炎病毒和鸽支原体的病毒作为dna模板，用试剂盒的扩增混合液进行pcr，扩增完毕后电泳观察，特异性试验电泳图如图1所示。

由图1可知，鸽痘出现766bp一个条带，而鸽衣原体、鸽疱疹病毒、鸽腺病毒、传染性喉气管炎病毒和鸽支原体均没有出现条带。回收阳性样本的条带，纯化后连接pmd18-t载体，转化dh5ɑ感受态细胞，取pcr鉴定为阳性菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。结果证实本试剂盒及检测方法具有很高的特异性，能准确扩增鸽痘病毒基因片段，并能直观鉴别诊断鸽痘病毒的感染情况。

(2)灵敏度试验

采用实施例1所得的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测方法提取鸽痘病毒样本dna，紫外分光光度计测定浓度后稀释调整病毒dna浓度为1.0pg·μl^-1，按照10倍浓度梯度稀释至10^-10，用试剂盒提供的扩增混合液进行pcr，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图2所示。

由图2可知，本发明的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒能检测的极限为1.0×10^-8pg·μl^-1，表明本发明的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测方法有很高的灵敏度。

(3)稳定性试验

将实施例1所得的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒保存在-20℃，每月1次用鸽痘病毒及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。

结果显示，6个月内鸽痘病毒pcr诊断试剂盒的检测结果完全一致，说明鸽痘病毒pcr诊断试剂盒有良好的稳定性。

(4)田间试验

采集发病鸽场组织病料、血清和喉头棉拭子样品共53份，采用实施例1所得的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法对其病毒感染情况进行检测诊断，具体如下：

实施例2

1、组织病料样品的处理

取疑似病例组织病料如痘痂、喉头气管3～5g，剪碎成糊状，加5倍无菌pbs缓冲液，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，在4℃下以12000r/min离心10min，吸取上清液，备用；

2、dna提取

2.1组织病料样品dna提取：吸取100μl所得上清液置入1.5ml无菌ep管，加入800μl裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μl冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，在4℃下以12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置ep管，在空气中自然干燥，用40μl8mmol·l^-1naoh溶解，得组织病料dna提取液；

2.2阴性对照样品提取：吸取100μl灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μl裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μl冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，在4℃下以12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置ep管，在空气中自然干燥，用40μl8mmol·l^-1naoh溶解，得阴性对照样品提取液；

3、pcr扩增反应

3.1组织病料样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液23μl，加入组织病料dna提取液2μl，混合均匀，进行pcr扩增反应，pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得组织病料样品pcr扩增产物；

3.2阴性对照样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液23μl，加入阴性对照样品提取液2μl，混合均匀，进行pcr扩增反应，pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品pcr扩增产物；

3.3阳性对照样品pcr扩增反应：取扩增反应混合液23μl，加入鸽痘病毒阳性质粒2μl，混合均匀，进行pcr扩增反应，pcr扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品pcr扩增产物；

4、电泳检测

将所得的组织病料样品pcr扩增产物、阴性对照样品pcr扩增产物、阳性对照样品pcr扩增产物通过10g·l^-1琼脂糖凝胶电泳进行检查诊断，具体如下：

4.1称取1.0g琼脂糖，加入100ml1×tae缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μl(100mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×tae缓冲液淹没胶面，得琼脂糖缓冲溶液；

4.2分别取5μl组织病料样品pcr扩增产物、阴性对照样品pcr扩增产物、阳性对照样品pcr扩增产物和琼脂糖缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μldl2000dna分子量标准；

4.3电压80v～100v，或电流40ma～50ma，电泳30min；

4.4取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相；

4.5以dl2000dna分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出766bp条带，说明对照成立；待检样品pcr扩增产物中出现766bp条带，即为鸽痘病毒感染；待检样品pcr扩增产物为无条带者，即为阴性。

实施例3

1、血清样品的处理

对疑似病例鸽子进行翅静脉采血，自然凝固，待血清析出后分离出血清，备用；

2、dna提取、pcr扩增反应和电泳检测

具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的组织病料样品替换为血清样品。

实施例4

1、喉头棉拭子样品的处理

将喉头棉拭子样品浸泡在1ml灭菌生理盐水中10分钟，充分挤压，5000r/min离心10min，取上清液，备用；

2、dna提取、pcr扩增反应和电泳检测

具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的组织病料样品替换为喉头棉拭子样品。

实施例2-4的电泳检测结果为：53份临床样品中，鸽痘阳性31份，阳性率58.4％。图3为部分组织病料、血清和喉头棉拭子的检测结果，由图3可知，3/5/6/8为鸽痘病毒感染阳性结果；4/7/9为阴性结果。田间试验证明本发明所得的鸽痘病毒pcr诊断试剂盒实用性和适用性良好。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。