用于评价抗TNF-α药物生物学活性的重组细胞及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域,涉及用于评价抗tnf-α药物生物学活性的重组细胞及其应用。

背景技术：

肿瘤坏死因子(tnf)和与之相对应的同源肿瘤坏死因子受体超级家族对维持免疫稳态及对不同的免疫反应采取正确的行动起到关键的作用。肿瘤坏死因子及其受体在免疫系统中参与多层次的调控作用，它们既能发现有潜在危险的或者多余的细胞，选择性诱导这些细胞死亡，又能提供共刺激信号来帮助建立有效免疫反应。这种对免疫的多样性调控在肿瘤免疫治疗药物的研究中取得重要的进展。肿瘤坏死因子受体超级家族介导的对肿瘤坏死因子的生理反应是用于治疗许多慢性炎症靶点的重要手段之一。

肿瘤坏死因子受体(tnfr)超级家族是属于细胞因子受体的一类蛋白超级家族，其特征在于其细胞膜外富含半胱氨酸的结构域能与肿瘤坏死因子结合。这些肿瘤坏死因子受体通常在细胞膜上表达为三聚体i型跨膜蛋白，在其胞外区有一至六个富含半胱氨酸的结构域。肿瘤坏死因子受体超级家族一共有27个家族成员，其中，tnfr1和tnfr2是最为重要的成员。对应于肿瘤坏死因子受体(tnfr)超级家族，肿瘤坏死因子(tnf)超级家族也有27个配体，它们都共有一个保守的羧基末端同源结构域，称之为tnf同源结构域(thd)。thd促进肿瘤坏死因子形成同源三聚体分子，在极少数情况下，肿瘤坏死因子会形成二聚体或异源三聚体，thd对tnf与tnfr相互作用是非常重要的。

肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子受体结合后的信号传导是复杂和多样化的，但最主要的是诱导细胞死亡，提供共刺激信号，或刺激细胞活化。tnf和tnfr诱导的细胞死亡信号通过tnfr1进行，这个过程需要释放细胞内tnfr抑制剂，死亡域沉默(sodd)蛋白，tnf与tnfr1的相互作用诱导了胱天蛋白酶依赖性凋亡细胞死亡。肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族的几个成员(cd27，4-1bb(cd137)，ox40(cd134)，hvem，cd30和gitr)在初始t细胞活化后能够维持t细胞的反应，这些共刺激tnfr家族成员的作用在功能上，时间上或空间上与cd28的作用是相互独立的，它们本身之间的作用在功能上，时间上或空间上也是相互独立的。与之肿瘤坏死因子名字的意义相反，tnf和tnfr信号通常不会杀死细胞，而是导致nf-κb或几个额外的非死亡信号通路的激活，tnf和tnfr信号不仅导致nf-κb的激活，而且激活了丝裂原活化蛋白激酶(mapk)和氨基末端激酶(jnk)相关的信号通路。tnf诱导的nf-κb的激活在炎症中起重要的作用，nf-κb是众多促炎症因子，趋化因子，及其受体的广谱的反式激活剂。

ht1080是一种广泛用于生物医学研究的纤维肉瘤细胞系，ht1080对tnf家族的所有死亡诱导配体导致的细胞凋亡有反应，ht1080细胞膜上有内源性的tnf-α受体的表达。虽然tnf-α一方面导致ht1080的凋亡，另一方面它又通过激活ht1080中的nf-κb的信号来抑制tnf-α对ht1080的凋亡作用，细胞死亡与否是由这二种机制的互相均衡决定的，nf-κb调节许多生物学重要基因的表达，如编码炎性细胞因子，干扰素，生长因子，细胞粘附分子和病毒的基因，ht1080细胞nf-κb的信号的强弱可以用分泌性碱性磷酸酶(seap)或荧光素酶的报告基因来检测，同时，tnf-α还会刺激hτ1080分泌白介素8(il-8)。

基于上面所描述的肿瘤坏死因子的重要作用，它们成为药物研发的非常重要的靶点，包含了癌症免疫治疗药物研发，炎症和自身免疫性疾病，心血管疾病，纤维化疾病和掌腱膜挛缩。目前市场上有五个肿瘤坏死因子靶向的生物类药被批准，它们用于治疗类风湿关节炎，炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性溃疡结肠炎)，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，幼年特发性关节炎，强直性脊柱炎，以及化脓性紫癜。有一个能够客观的衡量肿瘤坏死因子功能的体外活性的方法显得更为重要。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组ht1080细胞。

本发明的另一目的是提供该重组ht1080细胞的应用。

本发明的又一目的是提供评价抗tnf-α药物或肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用或抗肿瘤坏死因子受体类药物与其配体类药物的相互作用的生物学活性的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

用于检测肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的重组ht1080细胞，所述的重组ht1080细胞是在ht1080细胞上建立一个带有分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的报告基因系统，碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与nf-κb的启动子相连来驱动分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶的表达分泌；或者在上述建立的ht1080/荧光素酶的报告基因细胞上，转染一个外源性tnf受体，使细胞上稳定表达一个外源性tnf受体，构建得到ht1080/荧光素酶报告基因/人tnf受体稳定细胞。

所述的重组ht1080细胞优选，所述的分泌性碱性磷酸酶或荧光素酶报告基因与一个带有5个重复nf-κb结合序列，一个elam启动子相连，形成nf-κb(5x)-elam-seap/luciferase序列；将该序列插入慢病毒载体中替换掉原有启动子；使用第四代病毒包装系统(clontech的lenti-x^tmpackagingsingleshots(vsv-g))获得慢病毒并转染ht1080细胞，最后通过抗生素抗性及报告基因表达量筛选，抗生素抗性及报告基因表达量最高的细胞株即为所述的重组ht1080细胞。

作为所述的重组ht1080细胞的另一种优选，还可通过向所述的表达荧光素酶luciferase报告基因的ht1080细胞转染一个外源性tnf受体bcma，使细胞上稳定表达一个外源性bcma，得到ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞。

本发明所述的重组ht1080细胞的构建方法，包括以下步骤：

(1)全基因合成5个重复nf-κb结合序列，一个elam启动子，一个分泌型碱性磷酸酶seap或一个荧光素酶luciferase报告基因组成的nf-κb(5x)-elam-seap序列或nf-κb(5x)-elam-luciferase序列；将该序列插入慢病毒载体中，将原有的cmv启动子替换，得到带有相应抗生素抗性的nf-κb(5x)-elam-seap/nf-κb(5x)-elam-luciferase的plvx载体；

(2)采用第四代病毒包装系统(clontech的lenti-x^tmpackagingsingleshots(vsv-g))，使用聚乙烯亚胺pei转染法共转染293t细胞，进行慢病毒的包装；

(3)慢病毒转染ht1080细胞，通过相应抗生素抗性及分泌型碱性磷酸酶seap或荧光素酶luciferase表达量筛选，相应抗生素抗性及报告基因表达量最高的细胞株即为所述的重组ht1080细胞；

或者，在上述构建表达荧光素酶luciferase的重组ht1080细胞的基础上，还包含以下步骤：

(4)合成上游带有bstbi酶切位点、下游带有bamhi酶切位点的人bcma的dna序列，通过酶切插入带有puromycin抗性的plvx-puro质粒中，得到plvx-bcma-puro载体；

(5)采用第四代病毒包装系统(clontech的lenti-x^tmpackagingsingleshots(vsv-g))，使用聚乙烯亚胺pei转染法共转染293t细胞，进行慢病毒的包装；

(6)慢病毒转染上述构建的表达荧光素酶luciferase的重组ht1080细胞，通过puromycin抗性及使用流式细胞仪检测bcma表达，挑选puromycin抗性且bcma表达最高的细胞即为所述的重组ht1080细胞。

步骤(1)中当报告基因为分泌型碱性磷酸酶seap基因时，慢病毒载体优选plvx-puro载体；具有puromycin抗性。

步骤(1)中当报告基因为荧光素酶luciferase基因时，慢病毒载体优选plvx-hygro载体；具有hygromycin抗性。

本发明所述的是重组ht1080细胞在评价抗tnf-α药物生物学活性，评价药物对肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用，或评价药物对肿瘤坏死因子受体起激动剂或拮抗剂的作用中的应用。

所述的抗tnf-α药物优选包括疫苗，血液，血液成分，细胞，变应原，基因，组织，重组蛋白，抗体，多肽之中的任何一个抗tnf-α的生物药，或抗tnf-α的小分子药物。

一种评价抗tnf-α药物生物学活性的方法，将tnf-α加入本发明所述的重组ht1080细胞中孵育，或将tnf-α和抗tnf-α药物加入本发明所述的重组ht1080细胞中孵育，或将tnf-α和抗tnf-α受体的药物加入本发明所述的重组ht1080细胞中孵育，通过检测培养基上清中il-8含量或检测分泌型碱性磷酸酶seap、荧光素酶luciferase或外源性tnf受体表达量来评价抗tnf-α药物生物学活性。

一种评价肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性的方法，将肿瘤坏死因子受体的配体加入本发明所述的重组ht1080细胞中孵育，或将肿瘤坏死因子受体的配体和抗肿瘤坏死因子受体的配体的药物加入本发明所述的重组ht1080细胞中孵育，或将肿瘤坏死因子受体的配体和抗肿瘤坏死因子受体的药物加入本发明所述的重组ht1080细胞中孵育，通过检测培养基上清中il-8含量或检测分泌型碱性磷酸酶seap、荧光素酶luciferase或外源性tnf受体表达量来评价肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性。

本发明通过检测tnf-α在细胞里的下游信号通路的反应来评价抗tnf-α药物(生物药或小分子)的生物学活性和应用。tnf-α在细胞里的下游信号通路的反应的强弱是通过白介素8的分泌量以及任何与nf-kb的启动子相连报告基因,比如分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)的报告基因，荧光素酶的报告基因的强弱来评价。这种方法可以有效的评价包括疫苗，血液，血液成分，细胞，变应原，基因，组织，重组蛋白，抗体，多肽之中的任何一个抗tnf-α的生物药，它也可以有效的评价抗tnf-α的小分子药物。本发明所提的抗tnf-α的药物不仅指药物对tnf-α的直接作用，它还包括评价药物对肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用，以及评价药物对肿瘤坏死因子受体起激动剂或拮抗剂的作用，因为上述作用的功能都可以在tnf-α在细胞里的下游信号通路的报告基因,分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)及白介素8反应中表现出来。本发明肿瘤坏死因子受体涵盖肿瘤坏死因子受体1(tumornecrosisfactorreceptor1)，肿瘤坏死因子受体2(tumornecrosisfactorreceptor1)，淋巴毒素β受体(lymphotoxinbetareceptor)，ox40,cd40,fas受体(fasreceptor)，诱饵受体1(decoyreceptor1)，诱饵受体2(decoyreceptor2)，诱饵受体3(decoyreceptor3)；cd27,cd30,4-1bb，死亡受体3(deathreceptor3),死亡受体4(deathreceptor4),死亡受体5(deathreceptor5),死亡受体6(deathreceptor6),rank,骨保护素(osteoprotegerin),tweak受体(tweakreceptor),taci,baff受体(baffreceptor),疱疹病毒进入介体(herpesvirusentrymediator),神经生长因子受体(nervegrowthfactorreceptor),b细胞成熟抗原(b-cellmaturationantigen),糖皮质激素诱导相关tnfr(glucocorticoid-inducedtnfr-related),troy,和外胚层a2受体(ectodysplasina2receptor)。通过把肿瘤坏死因子受体1(tumornecrosisfactorreceptor1)，肿瘤坏死因子受体2(tumornecrosisfactorreceptor2)，淋巴毒素β受体(lymphotoxinbetareceptor)，ox40,cd40,fas受体(fasreceptor)，诱饵受体1(decoyreceptor1)，诱饵受体2(decoyreceptor2)，诱饵受体3(decoyreceptor3)；cd27,cd30,4-1bb，死亡受体3(deathreceptor3),死亡受体4(deathreceptor4),死亡受体5(deathreceptor5),死亡受体6(deathreceptor6),rank,骨保护素(osteoprotegerin),tweak受体(tweakreceptor),taci,baff受体(baffreceptor),疱疹病毒进入介体(herpesvirusentrymediator),神经生长因子受体(nervegrowthfactorreceptor),b细胞成熟抗原(b-cellmaturationantigen),糖皮质激素诱导相关tnfr(glucocorticoid-inducedtnfr-related),troy,或外胚层a2受体(ectodysplasina2receptor)的任何一个受体稳定的转染到ht1080细胞中，做一个所述受体的ht1080稳定细胞系，本发明提及的检测方法和和按本发明提及的构建与nf-kb的启动子相连报告基因都可适用。

有益效果

本发明用白介素8或报告基因(seap，荧光素酶等)来检测及评价抗tnf-α类药物的生物学活性及肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性，上述所列的药物的生物学活性获得的结果，从实验的灵敏性和稳定性都比常规的以细胞的增殖和杀伤来评价抗tnf-α类药物的生物学活性要好的多。本发明对抗tnf-α类药物的生物学活性，肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的生物学活性，以及抗肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的药物的生物学活性提供一个灵敏的，简单可靠的，全新的检测方法，为今后抗肿瘤坏死因子受体与其配体的相互作用的药物开发起重要的作用。

附图说明

图1.tnf-α刺激ht1080细胞系，ht1080/seap报告基因细胞系，及ht1080/luciferase报告基因细胞系分泌白介素8

其中ht1080:ec50＝1.98ng/ml，ht1080/seap：ec50＝1.96ng/ml，ht1080/luciferase：ec50＝2.18ng/ml。

图2.tnf-α刺激ht1080/seap报告基因细胞系分泌seap，其中ec50＝0.26ng/ml。

图3.tnf-α刺激ht1080/荧光素酶的报告基因细胞系释放荧光素酶，其中ec50＝0.75ng/ml

图4.抗tnf-α抗体adalimumab，对tnf-α在ht1080细胞系，ht1080/seap报告基因细胞系，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞系上刺激分泌白介素8的抑制

其中ht1080:ic50＝36.10ng/ml，ht1080/seap：ic50＝32.26ng/ml，ht1080/荧光素酶：ic50＝38.24ng/ml。

图5.抗tnf-α抗体adalimumab，对tnf-α刺激ht1080/seap报告基因细胞系分泌seap的抑制，其中ic50＝5.39ng/ml。

图6.抗tnf-α抗体adalimumab，对tnf-α刺激ht1080/荧光素酶报告基因细胞系释放荧光素酶的抑制，其中ic50＝6.14ng/ml。

图7.bcma在构建的ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上的表达

图8.b细胞激活因子baff(a图，ec50＝0.83μg/ml)或增殖诱导配体april(b图，ec50＝0.16μg/ml)刺激ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系分泌白介素8

图9.b细胞激活因子baff(a图，ec50＝3.09μg/ml)或增殖诱导配体april(b图，ec50＝0.51μg/ml)刺激ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系分泌荧光素酶

具体实施方式

本发明用报告基因,分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)及白介素8来检测及评价抗tnf-α药物(大分子或小分子)的生物学活性和应用，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。实施例1-3记载了三种重组细胞的构建方法。实施例4到实施例6阐述tnf-α与它的受体结合，实施例7到实施例9阐述抗tnf-α的药物对tnf-α与它的受体结合的影响，实施例10到实施例12阐述了在ht1080细胞上稳定表达一个外源性tnf受体，这个外源性tnf受体的配体与它在ht1080细胞中稳定转染进去的受体结合，在ht1080产生信号通路的激活。

实施例1构建重组ht1080/seap报告基因细胞

1)在ht1080细胞系上建立一个带有分泌性碱性磷酸酶(seap)报告基因系统，seap报告基因与nf-κb的启动子相连(nf-κb的五个串联重复序列)来驱动seap的表达分泌。

该系统的质粒设计包括了一个带有5个重复nf-κb结合序列，一个elam启动子，一个分泌型碱性磷酸酶(seap)，组成的nf-κb(5x)-elam-seap序列。最终以检测报告基因碱性磷酸酶seap的蛋白活性作为检测提高过表达或者其它外源基因活性的手段。

步骤一：elam启动子驱动的报告基因载体的构建；

全基因合成nf-κb(5x)-elam-seap的dna序列(seqidno.1)，其中上游带有clai酶切位点atcgat，下游带xhol酶切位点ctcgag，插入plvx-puro载体中，将原有的cmv启动子替换，得到带有nf-κb(5x)-elam-seap的plvx载体，并具有puromycin抗性。

步骤二：带有elam启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；

使用clontech的lenti-x^tmpackagingsingleshots(vsv-g)(catalognumber::631275)第四代病毒包装系统，使用聚乙烯亚胺pei转染法共转染293t细胞，进行慢病毒的包装。分别在转染后24小时，48小时，72小时收集293t细胞上清后混合在一起,采用高速离心经纯化浓缩后用pbs溶液重悬，获得的病毒滴度为1x10⁷ifu/ml。

步骤三：

取处于对数生长期的ht1080细胞接种于六孔板中，6x10⁵细胞每孔，加入3ml培养基，过夜培养。第二天去掉培养基，加入含有200ul慢病毒的新鲜培养基3ml，同时加入polybrene至终浓度4ug/ml。将六孔板置于eppendorf5810r离心机，25℃，800g离心30分钟。离心结束后，在37℃co2培养箱中持续培养。48小时后换液，加入含2ug/ml的嘌呤霉素puromycin的新鲜培养基进行抗性筛选，一周后得到多克隆细胞，通过有限稀释法获得多株单克隆ht1080细胞系。使用invivogen公司的seapreporterassay试剂盒进行seap报告酶检测后，挑选seap活性表达最高的单克隆细胞株即为分泌seap的重组ht1080细胞。

实施例2构建重组ht1080/荧光素酶报告基因细胞

在ht1080细胞系上建立一个带有荧光素酶的报告基因系统，荧光素酶的报告基因与nf-κb的启动子相连(nf-κb的五个串联重复序列)来驱动seap的表达分泌。该质粒设计包括了一个带有5个重复nf-κb结合序列，一个elam启动子，一个荧光素酶luciferase报告基因，组成nf-κb(5x)-elam-luciferase序列。最终以检测报告基因荧光素酶luciferase的蛋白活性作为检测提高过表达或者其它外源基因活性的手段。

步骤一：

全基因合成nf-κb(5x)-elam-luciferase的dna序列(seqidno.2)，其中上游带有clai酶切位点atcgat，下游带xhol酶切位点ctcgag，插入plvx-hygro载体中，将原有的cmv启动子替换。得到带有nf-κb(5x)-elam-luciferase的plvx载体，并具有hygromycin抗性。

步骤二：带有elam启动子驱动的报告基因的稳定细胞株的构建；

使用clontech的lenti-x^tmpackagingsingleshots(vsv-g)第四代病毒包装系统，使用聚乙烯亚胺pei转染法共转染293t细胞，进行慢病毒的包装。分别在转染后24小时，48小时，72小时收集293t细胞上清后混合在一起,采用高速离心经纯化浓缩后用pbs溶液重悬，获得的病毒滴度为1x10⁷ifu/ml。

步骤三：

取处于对数生长期的ht1080细胞接种于六孔板中，6x10⁵细胞每孔，加入3ml培养基，过夜培养。第二天去掉培养基，加入含有200ul慢病毒的新鲜培养基3ml，同时加入polybrene至终浓度4ug/ml。将六孔板置于eppendorf5810r离心机，25℃，800g离心30分钟。离心结束后，在37℃co2培养箱中持续培养。48小时后换液，加入含有2ug/mlhygromycin的新鲜培养基进行抗性筛选，一周后得到多克隆细胞，通过有限稀释法获得多株单克隆ht1080细胞系。使用promega公司的reagent试剂盒进行luciferase报告酶检测后，挑选luciferase活性表达最高的单克隆细胞株即为表达luciferase的重组ht1080细胞。

实施例3构建重组ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma细胞

在上述技术方案的第二阶段建立的ht1080/荧光素酶的报告基因细胞系上，转染一个外源性的tnf受体bcma，使细胞上稳定表达一个外源性bcma，构建一个ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系。

步骤一：

合成人bcma的dna序列(seqidno.3)，其中上游带有bstbi酶切位点ttcgaa，下游带有bamhi酶切位点ggatcc，通过酶切插入带有puromycin抗性的plvx-puro质粒中，得到plvx-bcma-puro载体，并具有puromycin抗性。

步骤二：bcma稳定细胞株的构建；

使用clontech的lenti-x^tmpackagingsingleshots(vsv-g)第四代病毒包装系统，，使用聚乙烯亚胺pei转染法共转染293t细胞，进行慢病毒的包装。分别在转染后24小时，48小时，72小时收集293t细胞上清后混合在一起,采用高速离心经纯化浓缩后用pbs溶液重悬，获得的病毒滴度为1x10⁷ifu/ml。

步骤三：

取处于对数生长期的ht1080/荧光素酶的报告基因细胞接种于六孔板中，6x10⁵细胞每孔，加入3ml培养基，过夜培养。第二天去掉培养基，加入含有200ul慢病毒的新鲜培养基3ml，同时加入polybrene至终浓度4ug/ml。将六孔板置于eppendorf5810r离心机，25℃，800g离心30分钟。离心结束后，在37℃co2培养箱中持续培养。48小时后换液，加入含有2ug/mlpuromycin的新鲜培养基进行抗性筛选，一周后得到多克隆细胞，通过有限稀释法获得多株单克隆ht1080荧光素酶的报告基因/人bcma细胞系。使用流式细胞仪检测ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma稳定细胞上的bcma表达，挑选bcma表达最高的单克隆细胞株。

实施例4tnf-α与ht1080细胞系上的tnf-α受体结合，刺激ht1080分泌白介素8

1)ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让tnf-α与在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的tnf-α

(4)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测经tnf-α与在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合后，刺激ht1080细胞系，ht1080/seap报告基因细胞系，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞系所分泌白介素8的量

(1)从每孔中取20μl上清，按照cisbo白介素8检测试剂盒的说明，检测培养基上清中il-8含量。

ht1080/seap报告基因细胞系及ht1080/荧光素酶报告基因细胞系都是用ht1080细胞系作为母细胞而构建的稳定转染的细胞系，所以和ht1080细胞一样，ht1080/seap报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因细胞都有tnf-α受体的表达，在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞中加入tnf-α，tnf-α与在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，刺激了ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞的白介素8分泌。加入细胞的tnf-α量越多，分泌的白介素8也越多。如图1所示，在tnf-α刺激后，ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞分泌的白介素8的量基本一致。

实施例5tnf-α与ht1080/seap细胞系上的tnf-α受体结合，刺激ht1080/seap分泌seap

1)ht1080和ht1080/seap报告基因细胞复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让tnf-α与在hτ1080和ht1080/seap报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的tnf-α

(4)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测经tnf-α与在ht1080/seap报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合后，刺激ht1080和ht1080/seap报告基因细胞分泌的seap量

(1)从每孔中取20μl上清，按照invivogenseap检测试剂盒的说明，检测培养基上清中seap含量

在ht1080/seap报告基因细胞中加入tnf-α，tnf-α与在ht1080/seap报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，刺激了ht1080/seap报告基因细胞，诱发了tnf-α受体的下游信号通路，激活了nfκb的信号，从而激活了被nfκb的信号控制的seap报告基因，ht1080/seap报告基因细胞分泌了seap。如图2所示，在tnf-α刺激后，ht1080/seap报告基因细胞分泌了seap，加入细胞的tnf-α量越多，分泌的seap量也越大。由于hτ1080母细胞没有seap报告基因的表达，所以加入tnf-α后也没有seap的分泌。

实施例6tnf-α与ht1080/荧光素酶细胞系上的tnf-α受体结合，刺激ht1080/荧光素酶细胞分泌荧光素

1)ht1080和ht1080/荧光素酶报告基因细胞复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让tnf-α与在ht1080和ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的tnf-α

(4)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测经tnf-α与在ht1080和ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合后，刺激ht1080/荧光素酶报告基因细胞分泌的荧光素酶

(1)每孔加入promega的30μlone-glo检测试剂，按照promegaone-glo荧光素酶检测试剂盒的说明，检测培养基中荧光素酶的强度

在ht1080/荧光素酶报告基因细胞中加入tnf-α，tnf-α与在ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，刺激了ht1080/荧光素酶报告基因细胞，诱发了tnf受体的下游信号通路，激活了nfκb的信号，从而激活了被nfκb的信号控制的荧光素酶报告基因，ht1080/荧光素酶报告基因细胞分泌了荧光素酶。如图3所示，在tnf-α刺激后，ht1080/荧光素酶报告基因细胞分泌了荧光素酶，加入细胞的tnf-α量越多，分泌的荧光素酶强度也越大。由于ht1080母细胞没有荧光素酶报告基因的表达，所以加入tnf-α后也没有荧光素酶的分泌。

实施例7抗tnf-α抗体adalimumab(阿达木单抗)，对tnf-α与ht1080细胞系，ht1080/seap报告基因细胞系，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞系上的tnf-α受体结合起中和作用，抑制了tnf-α在ht1080细胞系，ht1080/seap报告基因细胞系，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上对白介素8的分泌刺激作用。

1)ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让tnf-α与在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，加入抗tnf-α抗体adalimumab，adalimumab中和tnf-α与tnf-α受体的结合，从而抑制了tnf-α与ht1080细胞系，ht1080/seap报告基因细胞系，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞系上的tnf-α受体结合后对白介素8分泌的刺激作用。

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的adalimumab，培养箱孵育30分钟；

(4)在孔板中加入从实施例4获取的ec80的tnf-α浓度

(5)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测adalimumab在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上对tnf-α刺激白介素8的抑制。

(1)从每孔中取20μl上清，按照cisbo白介素8检测试剂盒的说明，检测培养基上清中il-8含量。

在ht1080,ht1080/seap报告基因细胞系及ht1080/荧光素酶报告基因细胞系中加入ec80的tnf-α浓度，tnf-α与在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，刺激了ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞的白介素8分泌。adalimumab是抗tnf-α的抗体，它与tnf-α结合，阻断了tnf-α与其细胞上的受体结合，中和了tnf-α的效应，从而抑制了tnf-α对白介素8的刺激。加入细胞的adalimumab量越多，对tnf-α介导的白介素8的刺激的抑制也越多。如图4所示，adalimumab对tnf-α介导的白介素8的刺激的抑制在ht1080细胞，ht1080/seap报告基因细胞，及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上基本一致。

实施例8抗tnf-α抗体adalimumab，对tnf-α与ht1080/seap报告基因细胞系上的tnf-α受体结合起中和作用，抑制了tnf-α在ht1080/seap报告基因细胞上对seap的分泌刺激作用。

1)ht1080细胞和ht1080/seap报告基因细胞的复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让tnf-α与在ht1080细胞和ht1080/seap报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，加入抗tnf-α抗体adalimumab，adalimumab中和了tnf-α与tnf-α受体的结合，从而抑制了tnf-α与ht1080/seap报告基因细胞系上的tnf-α受体结合后对seap分泌的刺激作用。

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的adalimumab，培养箱孵育30分钟；

(4)在孔板中加入从实施例5获取的ec80的tnf-α浓度

(5)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测adalimumab在ht1080/seap报告基因细胞上对tnf-α刺激seap的抑制。

(1)从每孔中取20μl上清，按照invivogenseap检测试剂盒的说明，检测培养基上清中seap含量

在ht1080及ht1080/seap报告基因细胞中加入ec80的tnf-α浓度，tnf-α与在ht1080细胞及ht1080/seap报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，刺激了ht1080/seap报告基因细胞的seap分泌。adalimumab是抗tnf-α的抗体，它与tnf-α结合，阻断了tnf-α与其细胞上的受体结合，中和了tnf-α的效应，从而抑制了tnf-α对seap的刺激。如图5所示，加入细胞的adalimumab量越多，对tnf-α介导的seap的刺激的抑制也越多。由于ht1080母细胞没有seap报告基因的表达，所以没有发现adalimumab对tnf-α的中和。

实施例9抗tnf-α抗体adalimumab，对tnf-α与ht1080/荧光素酶报告基因细胞系上的tnf-α受体结合起中和作用，抑制了tnf-α对ht1080/荧光素酶报告基因细胞对荧光素酶的分泌刺激作用。

1)ht1080细胞和ht1080/荧光素酶报告基因细胞的复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让tnf-α与在ht1080细胞和ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，加入抗tnf-α抗体adalimumab，adalimumab中和tnf-α与tnf-α受体的结合，从而抑制了tnf-α与ht1080/荧光素酶报告基因细胞系上的tnf-α受体结合后对荧光素酶分泌的刺激作用。

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的adalimumab，培养箱孵育30分钟；

(4)在孔板中加入从实施例6获取的ec80的tnf-α浓度

(5)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测adalimumab在ht1080/荧光素酶报告基因细胞上对tnf-α刺激荧光素酶的抑制。

(1)每孔加入promega的30μlone-glo检测试剂，按照promegaone-glo荧光素酶检测试剂盒的说明，检测培养基中荧光素酶的强度

在ht1080及ht1080/荧光素酶报告基因细胞中加入ec80的tnf-α浓度，tnf-α与在ht1080细胞及ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达的tnf-α受体结合，刺激了ht1080/荧光素酶报告基因细胞的荧光素酶分泌。adalimumab是抗tnf-α的抗体，它与tnf-α结合，阻断了tnf-α与其细胞上的受体结合，中和了tnf-α的效应，从而抑制了tnf-α对荧光素酶的刺激。如图6所示，加入细胞的adalimumab量越多，对tnf-α介导的荧光素酶的刺激的抑制也越多。由于ht1080母细胞没有荧光素酶报告基因的表达，所以没有发现adalimumab对tnf-α的中和。

实施例10在ht1080/荧光素酶报告基因细胞上表达人的b细胞成熟抗原(bcma)的稳定细胞系。用抗人bcma的抗体检测bcma在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上的表达。

1)ht1080/荧光素酶报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma稳定细胞的复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)用流式细胞仪检测ht1080/荧光素酶报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma稳定细胞上的bcma表达。

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟

(2)弃上清，在细胞里放入缓冲液，并把细胞铺在96孔板中

(3)在96孔板中，加入抗bcma抗体(biolegend：357504)及二抗；

(4)在流式细胞仪中检测bcma表达

如图7所示hτ1080/荧光素酶报告基因母细胞没有bcma的表达，而ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma稳定细胞有很高的bcma表达。

实施例11b细胞激活因子(baff)或增殖诱导配体(april)与ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上的表达它们的受体bcma结合，刺激ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系分泌白介素8。

1)ht1080/荧光素酶报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma稳定细胞的复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让baff或april与在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上的表达它们的bcma受体结合

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的baff或april

(4)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测经baff或april与在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上表达的它们的受体bcma结合后，刺激ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系分泌白介素8。

(1)从每孔中取20μl上清，按照cisbo白介素8检测试剂盒的说明，检测培养基上清中il-8含量。

在ht1080/荧光素酶报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系中加入bcma的配体baff或april，baff或april与在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上表达的它们的受体bcma结合，刺激了ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系细胞的白介素8分泌。如图8a和图8b所示，加入细胞的baff或april的量越多，分泌的白介素8也越多。由于ht1080/荧光素酶报告基因母细胞没有bcma的表达，所以在ht1080/荧光素酶报告基因母细胞加入baff或april后也没有白介素8的分泌。

实施例12b细胞激活因子(baff)或增殖诱导配体(april)与ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上的表达它们的受体bcma结合，刺激ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系分泌荧光素。

1)ht1080/荧光素酶报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因细胞/人bcma稳定细胞的复苏

(1)从液氮罐取细胞，37℃水浴快速解冻；

(2)转移至含有4ml完全培养基的15ml离心管，800rpm,离心5min,

(3)弃上清，用1ml完全培养基重悬细胞，

(4)转移至6-cmdish，补足5ml培养基,培养至70-80％的汇合度

2)让baff或april与在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上的表达的它们的受体bcma结合

(1)消化并收集细胞，800rpm离心5分钟；

(2)弃上清，并铺板在384孔板中

(3)在孔板中加入不同浓度的baff或april

(4)在37℃/5％co2培养箱中孵育

3)检测经baff或april与在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上表达的它们的受体bcma结合后，刺激ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系分泌荧光素。

(1)每孔加入promega的30μlone-glo检测试剂，按照promegaone-glo荧光素酶检测试剂盒的说明，检测培养基中荧光素酶的强度

在ht1080/荧光素酶报告基因细胞及ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系中加入bcma的配体baff或april，baff或april与在ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系上表达的它们的受体bcma结合，刺激了ht1080/荧光素酶报告基因/人bcma稳定细胞系细胞的荧光素酶表达。如图9a和图9b所示，加入细胞的baff或april的量越多，表达的荧光素酶也越多。由于ht1080/荧光素酶报告基因母细胞没有bcma的表达，所以在ht1080/荧光素酶报告基因母细胞加入baff或april后也没有荧光素酶的表达。

序列表

<110>南京传奇生物科技有限公司

<120>用于评价抗tnf-α药物生物学活性的重组细胞及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1847

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggatctgcgatcgctgaattctggggactttccactggggactttccactggggactttc60

cactggggactttccactggggactttccactcctgcagcagtggatattcccagaaaac120

tttttggatgcagttggggatttcctctttactggatgtggacaatatcctcctattatt180

cacaggaagcaatccctcctataaaagggcctcagcagaagtagtgttcagctgttcttg240

gctgacttcacatcaaagcttctatactgacctgagacagagccatggttctggggccct300

gcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcc360

cagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccg420

ccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatg480

ggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggatcctaaaagggcagaagaaggacaaac540

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tcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaaca720

cgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcag780

tgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccaca840

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gccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgatgtgatcctgggtggag960

gccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagcc1020

aaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagg1080

gtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtga1140

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cactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacc1260

cccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccacggtcatcacgaaagca1320

gggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggcc1380

agctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttct1440

ccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggccc1500

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cagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcg1680

gcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatgg1740

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<210>2

<211>1943

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccg1740

ttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgcca1800

gtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccga1860

aaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaaga1920

agggcggaaagatcgccgtgtaa1943

<210>3

<211>564

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gccgccaccatgttgcagatggctgggcagtgctcccaaaatgaatattttgacagtttg60

ttgcatgcttgcataccttgtcaacttcgatgttcttctaatactcctcctctaacatgt120

cagcgttattgtaatgcaagtgtgaccaattcagtgaaaggaacgaatgcgattctctgg180

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