本发明涉及酶制剂领域，具体而言，涉及一种磷脂酶d的生产工艺以及磷脂酶d制品。
背景技术：
磷脂酶(phospholipase，pl)是广泛存在生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点(richmondg.s.等，int.j.mol.sci.2011，12:588-612)不同，可将磷脂酶分为磷脂酶a1(pla1)、磷脂酶a2(pla2)、磷脂酶b(plb)、磷脂酶c(plc)、磷脂酶d(pld)以及溶血磷脂酶a(lysopla)，
pla1能够水解二脂肪酰基磷脂的sn-1位酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。pla2则是能够水解sn-2位的酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。plb则是能水解二脂肪酰基磷脂的sn-1位和sn-2位的两个酰基酯键产生甘油磷酰胆碱和游离脂肪酸的磷脂酶，该酶也同时具有溶血磷脂酶的活性。plc是能够水解甘油骨架和磷酸基之间的磷酸酯键产生二磷脂酰甘油和磷酸极性醇酯(如磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸肌醇等)。pld则是水解磷酸基和氨基醇之间的磷酸酯键生磷脂酸和氨基醇。溶血磷脂酶a则是指能够水解溶血磷脂的sn-1位或sn-2位的脂肪酰基酯键，产物是甘油磷酸胆碱和脂肪酸。
微生物具有生产周期短、生长条件简单、生产效率高等特点，利用微生物发酵获取磷脂酶一直是工业酶制剂领域研究的重点。
但是，采用现有发酵工艺获取磷脂酶存在诸多问题，例如磷脂酶产量低、磷脂酶酶活性不高、酶纯度低等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种磷脂酶d的生产工艺，该生产工艺的产量高、所生产的磷脂酶d具有较高的酶活性。
本发明的另一目的在于提供一种由上述生产工艺所生产的磷脂酶d制品，该磷脂酶d制品具有较高的酶活性。
本发明是这样实现的：
一种磷脂酶d的生产工艺，其包括：发酵步骤；
上述发酵步骤包括：将具有生产磷脂酶d性能的链霉菌属菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
其中，上述液体发酵培养基含有：葡萄糖4.5-5.5g/l、蛋白胨4.5-5.5g/l、酵母浸粉4.5-5.5g/l、柠檬酸三钠4.5-5.5g/l、kh2po41.8-2.2g/l以及mgso40.48-0.52g/l，ph6.8-7.2。
一种磷脂酶d制品，其由上述的磷脂酶d的生产工艺制得。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的磷脂酶d的生产工艺采用含有葡萄糖4.5-5.5g/l、蛋白胨4.5-5.5g/l、酵母浸粉4.5-5.5g/l、柠檬酸三钠4.5-5.5g/l、kh2po41.8-2.2g/l以及mgso40.48-0.52g/l，ph6.8-7.2的发酵培养液对链霉菌属菌株进行发酵培养生产磷脂酶d，该生产工艺一方面通过发酵环节的液体发酵培养基和发酵参数进行优化配置，得到链霉菌属菌株发酵的最佳条件，另一方面对纯化环节进行优化，最大程度地实现从发酵液中提取磷脂酶d，该生产工艺不仅有效地提高了产量，且所生产出的磷脂酶d具有较高的酶活性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种磷脂酶d的生产工艺以及磷脂酶d制品。进行具体说明。
一方面，本发明提供了一种磷脂酶d的生产工艺，其包括如下步骤：
发酵步骤；
发酵步骤包括：将具有生产磷脂酶d性能的褐色链霉菌(streptomyceschromofuscusdsm40273)接种至液体发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
其中，液体发酵培养基含有：葡萄糖4.5-5.5g/l、蛋白胨4.5-5.5g/l、酵母浸粉4.5-5.5g/l、柠檬酸三钠4.5-5.5g/l、kh2po41.8-2.2g/l以及mgso40.48-0.52g/l，ph6.8-7.2。
优选地，在本发明的一些实施方案中，液体发酵培养基含有：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母浸粉5g/l、柠檬酸三钠5g/l、kh2po42g/l以及mgso40.5g/l，ph7.0。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述液体发酵培养基还含有消泡剂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，发酵培养的条件为：压力0.048-0.052mpa、温度34-36℃、搅拌速度80-120rpm、溶氧25-35％。
优选地，在本发明的一些实施方案中，发酵培养的条件为：压力0.05mpa、温度35℃、搅拌速度100rpm、溶氧30％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，生产工艺还包括：磷脂酶d纯化步骤；
磷脂酶d纯化步骤包括：将发酵液经板框过滤、超滤浓缩、盐析以及冻干后，得到磷脂酶d成品。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，板框过滤的压力为0.2-0.3mpa、温度为15-30℃、流速300-500l/h。
优选地，在本发明的一些实施方案中，板框过滤的压力为0.2mpa、温度为20℃、流速500l/h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，超滤浓缩所用的超滤膜的分子截留量为10-30kda、流速为100-200l/h。
优选地，在本发明的一些实施方案中，超滤浓缩所用的超滤膜的分子截留量为10kda、流速为150l/h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，盐析为：按质量体积分数比为48-52％的量，往经过超滤浓缩后的得到发酵浓缩液中加入固体(nh4)2so4。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，生产工艺还包括：菌种活化步骤；
菌种活化步骤为：将链霉菌属菌株接种至固体活化培养基，待长出单菌落后，挑取单菌落接种至含液体活化培养基的摇瓶中，置于34-36℃、140-160rpm条件下，培养48-72h，得到用于接种至液体发酵培养基的种子液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，固体活化培养基含有：葡萄糖4.5-5.5g/l、蛋白胨4.5-5.5g/l、酵母浸粉4.5-5.5g/l、柠檬酸三钠4.5-5.5g/l、kh2po41.8-2.2g/l、mgso40.48-0.52g/l以及琼脂18-22g/l，ph6.8-7.2。
优选地，在本发明的一些实施方案中，固体活化培养基含有：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母浸粉5g/l、柠檬酸三钠5g/l、kh2po42g/l、mgso40.5g/l以及琼脂20g/l，ph7.0。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，液体活化培养基含有：葡萄糖4.5-5.5g/l、蛋白胨4.5-5.5g/l、酵母浸粉4.5-5.5g/l、柠檬酸三钠4.5-5.5g/l、kh2po41.8-2.2g/l以及mgso40.48-0.52g/l，ph6.8-7.2。
优选地，在本发明的一些实施方案中，液体活化培养基含有：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母浸粉5g/l、柠檬酸三钠5g/l、kh2po42g/l以及mgso40.5g/l，ph7.0。
另一方面，本发明提供了磷脂酶d制品，其根据上述的磷脂酶d的生产工艺制得。
本发明提供的磷脂酶d的生产工艺一方面通过发酵环节的液体发酵培养基和发酵参数进行优化配置，得到链霉菌属菌株发酵的最佳条件，另一方面对纯化环节进行优化，最大程度地实现从发酵液中提取磷脂酶d，该生产工艺不仅有效地提高了产量，且所生产出的磷脂酶d具有较高的酶活性。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的磷脂酶d的生产工艺包括如下步骤：
1菌种活化
1.1将-80℃保存的褐色链霉菌(streptomyceschromofuscusdsm40273)接种至灭菌的固体活化培养基，35℃，150rpm，培养至长出成熟的单菌落。
在本实施例中，所用固体活化培养基含有：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母浸粉5g/l、柠檬酸三钠5g/l、kh2po42g/l、mgso40.5g/l以及琼脂20g/l，ph7.0。
菌落成熟标志：直径：3cm左右；形态：圆形、脐突；肌理：褶皱、边缘啮蚀状不规整；色素：表面淡黄色。
1.2挑取成熟单菌落至液体活化培养基，置于35℃、150rpm条件下，培养48h，得到用于接种至灭菌的液体发酵培养基的种子液。
在本实施例中，所用液体发酵培养基含有：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母浸粉5g/l、柠檬酸三钠5g/l、kh2po42g/l以及mgso40.5g/l，ph7.0。
2发酵
按3％接种量，将得到的种子液接种至含有灭菌后的30l液体发酵培养基的70l发酵罐中进行发酵培养，得到发酵液。
其中，控制发酵参数：压力0.05mpa、温度35℃、搅拌速度100rpm、溶氧30％。发酵72h。
在本实施例中，所用液体发酵培养基含有：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母浸粉5g/l、柠檬酸三钠5g/l、kh2po42g/l、mgso40.5g/l以及聚乙二醇消泡剂0.5ml/l，ph7.0。
3纯化
3.1采用板框过滤对上述发酵液进行过滤，以除去发酵液中菌体以及非水溶性杂质，得到过滤液。
其中，板框过滤的压力为0.2mpa、温度为20℃、流速500l/h；
3.2对得到过滤液进行超滤浓缩，得到发酵浓缩液。
其中，所用的超滤膜的分子截留量为10kda、流速为150l/h。
3.3盐析：按质量体积分数比(g/l)为50％的量，往上述发酵浓缩液中加入固体(nh4)2so4，收集沉淀。当盐离子浓度达到饱和或半饱和程度时，使磷脂酶d从溶液中析出、沉淀。
3.4收集的沉淀进行冻干处理，得到磷脂酶d成品。
4磷脂酶d活力检测
方法如下
(1)反应试剂配制：
配制反应液a：100ml，ph7.4。
取卵磷脂0.5g，tritonx-1000.5g，tris-his0.6g，胆碱氧化酶100u，cacl2·2h2o8mg，用蒸馏水溶解，然后定容至100ml，用hcl或naoh调ph到7.4。
配制中止反应液b：100ml，ph7.4。
取tris-his0.6g，edta2g，蒸馏水溶解，然后定容至100ml。用hcl或naoh调ph到7.4。
配制缓冲液：100ml，调ph到7.4。
取tris-his0.6g，蒸馏水溶解，然后定容至100ml，用hcl或naoh调ph到7.4。
(2)检测步骤:
a、标准品酶液制备：称量已知酶活的标准品(1500u/g，称取0.01g)溶于一定体积(10ml)缓冲液中；取0.01g磷脂酶d成品溶于10ml缓冲液中；
b、sba-40c生物传感分析仪预热；
c、取反应液a0.5ml，加酶液0.1ml混匀，水浴37度，10min，加中止反应液b0.5ml混匀，样品放置于冰水混合物中即时检测，按仪器操作说明进行检测；
d、取标准品酶液定标，测量磷脂酶d成品溶液的酶活。
结果显示：本实施例提供得到的磷脂酶d成品质量为：150g，磷脂酶d成品的酶比活力为：3200u/g。
实施例2
本实施例提供的磷脂酶d的生产工艺与实施例1基本相同，不同的是：
在发酵培养步骤中的发酵参数为：压力0.052mpa、温度36℃、搅拌速度80rpm、溶氧25％。
经检测，本实施例得到磷脂酶d成品质量为：104g，磷脂酶d成品的酶比活力为：2650u/g。
实施例3
本实施例提供的磷脂酶d的生产工艺与实施例1基本相同，不同的是：
在发酵培养步骤中的发酵参数为：压力0.048mpa、温度34℃、搅拌速度120rpm、溶氧35％。
经检测，本实施例得到磷脂酶d成品质量为：112g，磷脂酶d成品的酶比活力为：2700u/g。
对比例1
本对比例提供的磷脂酶d的生产工艺与实施例1基本相同，不同的是：
在发酵培养步骤中的发酵参数为：压力0.04mpa、温度30℃、搅拌速度150rpm、溶氧40％。
经检测，本实施例得到磷脂酶d成品质量为：76g，磷脂酶d成品的酶比活力为：2130u/g。
对比例2
本对比例提供的磷脂酶d的生产工艺与实施例1基本相同，不同的是：
在发酵培养步骤中的发酵参数为：压力0.06mpa、温度37℃、搅拌速度70rpm、溶氧20％。
经检测，本实施例得到磷脂酶d成品质量为：65g，磷脂酶d成品的酶比活力为：2065u/g。
对比例3
本对比例提供的磷脂酶d的生产工艺与实施例1基本相同，不同的是：
在发酵培养步骤中的发酵参数为：压力0.07mpa、温度38℃、搅拌速度200rpm、溶氧45％。
经检测，本实施例得到磷脂酶d成品质量为：45g，磷脂酶d成品的酶比活力为：1640u/g。
对比例4
本对比例提供的磷脂酶d的生产工艺与实施例1基本相同，不同的是：
在发酵培养步骤中的发酵参数为：压力0.03mpa、温度30℃、搅拌速度60rpm、溶氧15％。
经检测，本实施例得到磷脂酶d成品质量为：57g，磷脂酶d成品的酶比活力为：1335u/g。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。