一种硫酸软骨素D四糖的制备方法与流程

本发明涉及一种硫酸软骨素d四糖的制备方法，属于生物化工技术领域。

背景技术：

硫酸软骨素是从动物软骨中提取的一种粘多糖，由乙酰氨基半乳糖和葡萄醛酸连接而成，在医药、保健、食品、化妆品等各个领域均有使用。硫酸软骨素目前已被用于神经痛、关节痛、关节炎等疾病的临床治疗。硫酸软骨素潜在的生物活性包括抗炎、免疫调节、神经营养和预防骨质疏松等。然而由于其高分子量、结构不均匀的特点以及细胞膜的透过性低等因素，天然硫酸软骨素存在生物利用率低、疗效不稳定等问题。

低分子硫酸软骨素越来越受到人们的重视，美国专利usp3405120已证明，分子量在3500-5300道尔顿时，硫酸软骨素在防治动脉粥样硬化、风湿性炎症等方面具有最强的药理活性。这些低分子硫酸软骨素仍然是不同分子量的混合物。

中国专利《一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法》(申请号201210159448.9)已经公开了不同分子量寡糖的制备方法，包括酶解、分子筛、离子交换和制备电泳等手段。这种方法的产量较小，并且受限于制备电泳产量，此工艺无法实现放大生产。

目前对硫酸软骨素特定结构和分子量寡糖的分离提取方法还没有报道。

技术实现要素：

本发明针对上述不足，提供一种硫酸软骨素d四糖的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种硫酸软骨素d四糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)硫酸软骨素d的酶法降解：鲨鱼硫酸软骨素5g，按5％(w/v)的浓度溶于ph8.0缓冲溶液中，加入50iu硫酸软骨素ac酶，37℃搅拌酶解48h；反应结束后，加入5倍体积95％乙醇沉淀，冷冻干燥，得到硫酸软骨素寡糖混合物；

选择硫酸软骨素ac酶用来降解鲨鱼硫酸软骨素的目的，是为了选择性的降解非硫酸软骨素d二糖组分，而保留尽可能多的硫酸软骨素d寡糖。

(2)硫酸软骨素d寡糖混合物的阴离子交换分离：将步骤(1)得到的样品用0.15mol/l的nacl溶液溶解成0.1g/ml，色谱柱2.6×20cm，qsepharosefastflow强阴离子交换填料，紫外检测波长232nm，进样量10ml，流动相0.15mol/l和1.2mol/l的nacl溶液，流速1.33ml/min，梯度洗脱，收集所得到的不同组分；

(3)硫酸软骨素d寡糖的凝胶过滤脱盐：将步骤(2)收集到的组分进行g-25葡聚糖凝胶过滤脱盐，脱盐后浓缩冻干；

(4)硫酸软骨素d寡糖的凝胶过滤分离：将步骤(3)冻干的样品用纯化水溶解成0.1g/ml，色谱柱1.6×100cm，bio-gelp6聚丙烯酰胺凝胶填料，紫外检测波长232nm，流动相0.2mol/lnacl溶液，流速0.4ml/min，进样量2ml，收集所得到的不同组分；

(5)硫酸软骨素d寡糖的凝胶过滤脱盐：将步骤(4)收集到的组分进行g-25葡聚糖凝胶过滤脱盐后浓缩冻干,即得硫酸软骨素d四糖。

本发明的有益效果是：以鲨鱼硫酸软骨素为原料，特异性的选择了硫酸软骨素ac酶降解，经乙醇沉淀、阴离子交换分离、凝胶分离等步骤，制备得到确切结构和分子量的硫酸软骨素d四糖，为硫酸软骨素寡糖单体的研究提供了可能性。

本发明的所使用的分离设备规模与中国专利《一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法》(申请号201210159448.9)相当，但是每批产出的单一硫酸软骨素d四糖可高达100mg，而中国专利《一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法》的投料量才40mg，产量很小。

所以本发明所描述的工艺是针对特定结构硫酸软骨素d寡糖设计的，这种工艺步骤可以专门对高硫酸化的硫酸软骨素，如硫酸软骨素d或硫酸软骨素e寡糖进行高效率纯化，本方案并不能根据现有理论推测得到，而是结合产品特性实验了大量纯化材料后得出。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在步骤(2)中，收集硫酸软骨素d寡糖混合物的阴离子交换分离的最后一个洗脱组分。

采用上述进一步方案的有益效果是：硫酸软骨素d寡糖的负电荷密度最高，因此在阴离子交换中最后被洗脱出来。

进一步，在步骤(4)中，收集硫酸软骨素d寡糖凝胶过滤分离后的最后一个洗脱组分。

采用上述进一步方案的有益效果是：硫酸软骨素d寡糖的电荷密度最高，所以存在于阴离子交换中最后的洗脱的组分中，并且其分子量最小，因此在凝胶过滤分离中同样最后被洗脱出来。

附图说明

图1硫酸软骨素寡糖的qff阴离子交换色谱图；

图2硫酸软骨素寡糖的p6凝胶色谱图；

图3硫酸软骨素d四糖的酶解液相图谱；

图4硫酸软骨素d四糖的质谱图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例一

(1)鲨鱼硫酸软骨素5g，按5％(w/v)的浓度溶于ph8.0缓冲溶液中，加入50iu硫酸软骨素ac酶，37℃搅拌酶解48h；反应结束后，加入5倍体积95％乙醇沉淀，冷冻干燥，得到硫酸软骨素寡糖混合物。

(2)将步骤(1)得到的样品用0.15mol/l的nacl溶液溶解成0.1g/ml，色谱柱规格2.6×20cm，qsepharosefastflow强阴离子交换填料，紫外检测波长232nm，进样量10ml，流动相0.15mol/l和1.2mol/l的nacl溶液，流速1.33ml/min，梯度洗脱，收集洗脱体积1350-1550ml处，即最后一个波峰。见图1。

(3)将步骤(2)收集到的组分进行g-25葡聚糖凝胶过滤脱盐后浓缩冻干。

(4)将步骤(3)冻干的样品用纯化水溶解成0.1g/ml，色谱柱1.6×100cm，bio-gelp6聚丙烯酰胺凝胶，紫外检测波长232nm，流动相0.2mol/lnacl溶液，流速0.4ml/min，进样量2ml，收集洗脱体积210-230ml处，即最后一个波峰。见图2。

(5)将步骤(4)收集到的组分进行g-25葡聚糖凝胶过滤脱盐后浓缩冻干。

产品验证：硫酸软骨素d四糖的检测

使用中国药典酶解液相方法来初步判断产品的纯度和及二糖结构，结果显示硫酸软骨素d二糖含量为95％。见图3。

经过质谱检测确认其分子量为1078，与硫酸软骨素d四糖理论计算值一致，证明产品为硫酸软骨素d四糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种硫酸软骨素D四糖的制备方法，属于生物化工技术领域。其以鲨鱼硫酸软骨素为原料，采用硫酸软骨素AC酶降解，经乙醇沉淀、阴离子交换色谱分离、凝胶色谱分离等步骤，制备得到硫酸软骨素D四糖。本发明的有益效果是：可制备得到确切结构和分子量的硫酸软骨素D四糖，产量较大，为硫酸软骨素寡糖单体的研究提供了可能性。

技术研发人员：李燕妮
受保护的技术使用者：滨州医学院
技术研发日：2017.11.28
技术公布日：2018.05.25