用于ctDNA文库构建的接头混合物、包括其的试剂盒及应用的制作方法

文档序号:14468862
用于ctDNA文库构建的接头混合物、包括其的试剂盒及应用的制作方法
本发明涉及生物医学
技术领域
,具体而言,涉及一种用于ctDNA文库构建的接头混合物、包括其的试剂盒及应用。
背景技术
:癌症患者的外周循环血中含有多种与癌症相关的突变基因,主要由肿瘤细胞脱落或凋亡后释放出的DNA进入循环系统,称之为ctDNA。ctDNA来自肿瘤细胞本身,是一种高度灵敏、特异性的特征性肿瘤生物标志物,可通过对其进行基因检测,进行定性、定量以及动态追踪观察肿瘤中发生突变的基因,从而为患者在早期诊断、用药指导、耐药和复发监测等方面提供有效信息。然而,精确测序ctDNA存在两个巨大的技术障碍:首先是血浆中的ctDNA含量极低,且多为小片段分子特点,导致提取较为困难,损失量大,检测灵敏度较低,因此限制了其在临床上的应用。其次是由于后续的建库过程中经过末端修复、腺苷酸化、加接头以及PCR扩增等多步骤后,样本会损失更多,进一步限制了检测灵敏度,因此增加每步实验的效率对提高ctDNA的检出灵敏度都至关重要。目前illumina公司的测序平台是所有高通量测序领域应该最广的,而应用于illmina平台的建库方法以illumina的Truseq系列与KAPA的DNA建库试剂盒应用最为广泛。其中,TruseqDNA建库主要包括以下步骤:1)末端修复,5’端磷酸化:通过3’末端延伸或者去掉两端突出的单链,将DNA双链的片段修复成平末端,并且将5’末端磷酸化,便于接下来的末端加A以及加接头反应,反应完成后进行产物纯化用于后续反应;)腺苷酸化:在末端修复后的3’末端加一个A,这个突出的腺苷酸用来与接头上的突出的的T配对,产物纯化用于后续反应;3)连接接头:在接头的3’末端有T与修复后的DNA双链上的A互补,产物纯化用于后续反应;4)PCR富集:用P5,P7的引物对文库进行扩增富集。KAPADNA建库:建库主要包括以下步骤:1)末端修复、腺苷酸化、连接接头:末端修复、腺苷酸化、连接接头在一PCR管中完成后进行产物纯化用于后续反应;2)PCR富集:用P5,P7的引物对文库进行扩增富集。与TruseqDNA建库建库相比,减少了2次磁珠纯化,避免样本的损失,减少人工操作步骤。现有技术中的一典型的接头序列如下:接头序列(Adapter1top)具有SEQIDNO:1(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)的氨基酸序列,接头序列(Adapter1bot)具有SEQIDNO:2(3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTATAGGACATCACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGp-5)的氨基酸序列,如图1所示,其中实线框内的为P5序列;虚线框内的为P7反向互补序列;具有下划线部分为反向互补区域;加粗T为接头突出末端;接头进行磷酸化处理。不管是TruseqDNA建库还是KAPA的DNA建库都同样是经过末端修复、3’端加A后与接头上突出的T进行互补连接,只有片段两端都加上A并与含T的接头进行连接后的产物才会被后续的PCR进行富集,然而片段3’最末端的碱基不同加A效率不同,而且片段末端加A的效率也受样本类型、样本质量以及反应时间等因素的影响,而片段一端没有加上A以及片段两端都没有加上A的片段就会损失,不能进入下游的实验,增加了样本损耗。技术实现要素:本发明旨在提供一种用于ctDNA文库构建的接头混合物、包括其的试剂盒及应用,以减少末班的损失,从而提高检测的灵敏度。为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种用于ctDNA文库构建的接头混合物。该接头混合物包括第一接头、第二接头和第三接头,第一接头包括Adapter1top和Adapter1bot两条序列,Adapter1top3’末端悬T,Adapter1bot5’末端磷酸化,Adapter1top3’末端与Adapter1bot5’末端具有互补区域;第二接头包括Adapter2top1和Adapter2top2两条序列,Adapter2top1与Adapter1top相同,Adapter2top2与Adapter2top1为完全互补序列;第三接头包括Adapter3top1和Adapter3top2两条序列,Adapter3top1为Adapter1bot3’末端加A,Adapter3top2与Adapter3top1为完全互补序列。进一步地,Adapter1top5’末端为P5序列,Adapter1bot3’末端为P7反向互补序列。进一步地,Adapter1top的序列为SEQIDNO:1,Adapter1bot的序列为SEQIDNO:2,Adapter2top1的序列为SEQIDNO:1,Adapter2top2的序列为SEQIDNO:3;Adapter3top1的序列为SEQIDNO:4,Adapter3top2的序列为SEQIDNO:5。进一步地,第一接头、第二接头和第三接头的摩尔比为1~20~50~20~50。根据本发明的另一方面,提供了一种用于ctDNA文库构建的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种接头混合物。进一步地,包括用于接头连接的试剂和PCR扩增的试剂。根据本发明的再一方面,提供了一种上述任一种接头混合物在ctDNA文库构建中的应用。应用本发明的技术方案,第二接头和第三接头能够结合加A不成功的模板,减少了模板的损失,增加检测灵敏度。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:图1示出了现有技术中的一种接头序列结构示意图;以及图2示出了经过加A处理后的片段会出现的类型示意图。具体实施方式需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。本发明的发明人发现,由于现有技术所用接头只能用于片段两端都有效加入A的模板进行连接,而模板两端加A效率又受多种因素影响,导致样本损耗而影响检测灵敏度。针对该技术问题,本发明提供了一种含有突出T以及平末端接头混合物,不仅能够将末端有效加A的片段进行连接,而且可以将末端未有效加A的片段进行平末端连接。以此增加连接效率,提供检测灵敏度。根据本发明一种典型的实施方式,提供一种用于ctDNA文库构建的接头混合物。该接头混合物包括第一接头、第二接头和第三接头,第一接头包括Adapter1top和Adapter1bot两条序列,Adapter1top3’末端悬T,Adapter1bot5’末端磷酸化,Adapter1top3’末端与Adapter1bot5’末端具有互补区域;第二接头包括Adapter2top1和Adapter2top2两条序列,Adapter2top1与Adapter1top相同,Adapter2top2与Adapter2top1为完全互补序列;第三接头包括Adapter3top1和Adapter3top2两条序列,Adapter3top1为Adapter1bot3’末端加A,Adapter3top2与Adapter3top1为完全互补序列。第二接头和第三接头能够结合加A不成功的模板,减少了模板的损失,增加检测灵敏度。为了后续测序的方便,优选的,Adapter1top5’末端为P5序列,Adapter1bot3’末端为P7反向互补序列。更优选的,Adapter1top的序列为SEQIDNO:1,Adapter1bot的序列为SEQIDNO:2,Adapter2top1的序列为SEQIDNO:1,Adapter2top2的序列为SEQIDNO:3;Adapter3top1的序列为SEQIDNO:4,Adapter3top2的序列为SEQIDNO:5。第一接头与现有技术接头一样:Adapter1top(SEQIDNO:1):5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’Adapter1bot(SEQIDNO:2):3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTATAGGACATCACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGp-5’第二接头:Adapter2top(SEQIDNO:1):5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’Adapter2bot(SEQIDNO:3):3’-TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGA-5’上述接头两条序列完全反向互补第三接头3:Adapter3top(SEQIDNO:4):5’-caagcagaagacggcatacgagatatcctgtagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’Adapter3bot(SEQIDNO:5):3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTATAGGACATCACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGA-5’上述接头两条序列完全反向互补第二接头与第三接头都没有突出碱基T,而且5’端未进行磷酸化处理,可以保证接头与未有效加A的模板进行有效连接,而且可以避免接头间与接头内的连接,提高连接效率,保证更多的模板加上接头并成功用于测序。根据本发明一种典型的实施方式,第一接头、第二接头和第三接头的摩尔比为1~20~50~20~50。在此摩尔比范围内,通过增加第二接头与第三接头的比例来增加第二接头与第三接头的连接效率。根据本发明一种典型的实施方式,提供了一种用于ctDNA文库构建的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种接头混合物。为了方便使用,优选的,该试剂盒还包括用于接头连接的试剂和PCR扩增的试剂。根据本发明一种典型的实施方式,提供了一种上述任一种接头混合物在ctDNA文库构建中的应用。根据本发明一典型的实施方式,本发明提供接头混合物如下:由于现有技术是经过末端修复与磷酸化、加A、加接头、PCR扩增等过程,而经过加A处理后的片段会分为以下3类,如图2所示:类型1为单端加上A的片段:类型2为两端都未加上A的片段:类型3为两端都加上A的片段。而上述三种类型中只有类型3的片段才能有效与含有突出T的接头进行连接;而类型1只有一端与含有T的接头进行有效连接,另外一端如果不能有效连接接头,一样无法做为有效模板进行PCR富集;而第二接头2两端都无法与含有突出T接头有效连接,而无法进行后续的PCR富集,考虑到类型1与类型2的这类模板,本发明提供了能够与平末端接头进行有效连接的平末端第二接头2与平末端第三接头3,而平末端第二接头2与平末端第三接头3分别为含有P5与P7端接头的序列,只有两端分别加上第二接头2与第三接头3时才能成为有效模板进行后续的PCR扩增,而只加上第二接头2或者第三接头3的模板会由于两端接头一样在后续扩增过程中被稀释而不能成为主要模板,而且也不能正常上机。而两端分别加上第二接头2和第三接头3的比例可以占到50%,从而可以把部分类型1与类型2两种模板变为有效模板而增加检测灵敏度,另外,还有一部分一端接接头1,另一端接接头2或3的模板,这部分模板部分能够成为有效模板,减少了现有技术大量模板的损失。下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。实施例1一、血浆游离DNA(cfDNA)样本制备使用Qiagen公司血浆游离DNA提取试剂盒提取1位健康人血浆20ml,提取得到cfDNA总量60ng,平均分成4份,每份15ng,其中2份使用KAPA公司原装DNA建库试剂盒+接头1进行文库构建(对照文库1和对比文库2),另外两份使用KAPA公司原装DNA建库试剂盒+接头1/2/3混合物进行文库构建(实验文库1和实验文库2)。二、DNA文库构建(1)末端修复、加A在PCR管里按下表1配置反应液,用枪轻柔地上下吹吸混匀。表1:放入PCR仪,按下表2的程序进行反应。表2:(2)接头连接在PCR管里按下表3配置反应液,用枪轻柔地上下吹吸混匀。表3:将配置好的反应体系均分成2管,放于PCR仪上,20℃温浴15min。最后,用1倍体积的AMPureXP磁珠纯化连接好接头的文库,23μL无核酸酶的水洗脱。(4)扩增连接上了接头的文库在PCR管里按下表4配置反应液,用枪轻柔地上下吹吸混匀。表4:上游引物序列:P5:AATGATACGGCGACCACCGAGA下游引物序列:CAAGCAGAAGACGGCATACGAG放入PCR仪,按下表5设置的程序进行反应。表5:将扩增好的PCR产物用等体积倍的AMPureXP磁珠纯化,30μL无核酸酶的水洗脱。三、文库定量使用qubit对文库进行定量,定量结果定表6:表6:文库名文库体积(μl)文库浓度(ng/μl)库容(ng)对照文库13025750对照文库23024720实验文库130401200实验文库230381140实验文库1和2库容明显高于对照文库1和2的库容,说明本发明接头连接效率高于对照。以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>北京科迅生物技术有限公司<120>用于ctDNA文库构建的接头混合物、包括其的试剂盒及应用<130>PN79647KXSW<160>5<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>58<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>接头序列<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>2<211>65<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>primer_bind<222>(1)..(65)<223>接头序列<400>2gttcgtcttctgccgtatgctctataggacatcactgacctcaagtctgcacacgagaag60gctag65<210>3<211>58<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>接头序列<400>3ttactatgccgctggtggctctagatgtgagaaagggatgtgctgcgagaaggctaga58<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>primer_bind<222>(1)..(66)<223>接头序列<400>4caagcagaagacggcatacgagatatcctgtagtgactggagttcagacgtgtgctcttc60cgatct66<210>5<211>66<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221>primer_bind<222>(1)..(66)<223>接头序列<400>5gttcgtcttctgccgtatgctctataggacatcactgacctcaagtctgcacacgagaag60gctaga66当前第1页1 2 3 
再多了解一些
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