用于检测黍子抗旱性遗传差异的五碱基重复基序分子标记的制作方法

文档序号:13978308

本发明属于分子生物遗传标记技术领域,涉及用于检测黍子遗传差异的分子标记,特别是含有五碱基重复基序的分子标记。



背景技术:

黍子(Panicum miliaceum L.),起源于中国黄河流域,是世界上最早驯化的栽培作物之一。黍子抗旱耐瘠,生育期短,是北方冷凉地区的特色物种。目前全球气温日益增高,培育筛选抗旱作物势在必行。黍子环境适应性强,搞清黍子的遗传背景,是有效利用黍子的前提。

分子标记能从DNA水平上揭示黍子的遗传多样性,是分子标记辅助育种的关键。微卫星标记以简单序列重复为特点,包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复等。

虽然现有报道检测黍子遗传差异的DNA标记较多,但微卫星标记欠缺且多来自于种间。由于黍子特异性SSR标记不多,且多为三碱基重复单元,四核苷酸重复基元较少,五碱基重复基元尚缺,导致黍子遗传图谱构建受限,黍子优异基因难以通过基因工程手段在大宗作物遗传改良中发挥作用。因此,有必要开发挖掘五碱基重复序列,利用这些功能基因组元件,有效实现大宗作物的抗旱耐盐性遗传改良。



技术实现要素:

本发明的目的是构建一组用于检测黍子抗旱性遗传差异的五碱基重复基序分子标记,利用这些分子标记可以进行抗旱性黍子的种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究和分子标记辅助育种。

提供用于检测所述分子标记的引物对,是本发明的另一发明目的。

本发明所述的一组用于检测黍子抗旱性遗传差异的五碱基重复基序分子标记是具有序列表SEQ ID No.1~SEQ ID No.5所示碱基序列的一组微卫星标记,微卫星标记编号分别为RYW5、RYW6、RYW7、RYW8、RYW32。

其中RYW5为603个核苷酸,具有5次重复的五碱基重复基序(CCTTT)5,RYW6为325个核苷酸,具有5次重复的五碱基重复基序(ACACC)5,RYW7为439个核苷酸,具有5次重复的五碱基重复基序(CGCGC)5,RYW8为625个核苷酸,具有5次重复的五碱基重复基序(AATAG)5,RYW32为625个核苷酸,具有5次重复的五碱基重复基序(ATCTT)5

进而,本发明所述的分子标记分别由各自的引物对扩增得到。其中,用于扩增RYW5的引物对具有序列表SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的碱基序列,用于扩增RYW6的引物对具有序列表SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的碱基序列,用于扩增RYW7的引物对具有序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的碱基序列,用于扩增RYW8的引物对具有序列表SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的碱基序列,用于扩增RYW32的引物对具有序列表SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的碱基序列。

本发明通过黍子五碱基核苷酸重复序列mRNA富集文库构建和含五碱基核苷酸重复序列测序,得到了一组5个五碱基核苷酸重复序列,开发确定了5个多态性丰富的黍子五碱基重复基序微卫星标记RYW5、RYW6、RYW7、 RYW8、RYW32,以及用于扩增该5个五碱基重复基序位点的专用引物。

本发明上述提供的一组五碱基重复基序分子标记可以应用于检测黍子的抗旱性遗传差异。

具体地,本发明所述一组五碱基重复基序分子标记可以在抗旱性黍子的种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究、分子标记辅助育种等方面得到应用。

以本发明所述一组5个多态性丰富的黍子五碱基重复基序分子标记进行抗旱性黍子种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究和分子标记辅助育种,重复性好,是一种可靠有效的分子标记。

本发明开发的五碱基重复基序分子标记用于检测来源于不同生态区的抗旱性黍子种质时,条带清晰,重复性好,多态性高,是抗旱性黍子特异性的微卫星标记。

本发明选取来源于不同生态栽培区的96份黍子种植资源,以本发明上述五对引物扩增多态性,发现平均每对引物检测到的等位基因数为3个,检测效果显著。其中,多态性信息含量0.6030,多样性指数0.8783,均高于以往研究结果(最高分别为0.49和0.53)。说明黍子遗传多样性丰富,本发明提供的检测用分子标记是有效的评估工具。

附图说明

图1是以扩增RYW7的引物对扩增39份黍子材料的电泳图。

具体实施方式

实施例1。

在温室中种植抗旱性差异显著的两个品种:耐旱品种黄糜子(编号00005272)和干旱敏感品种镇原大糜子。

剪取三叶期叶片组织,用Trizol plus kit(ThermoFisher,USA)试剂盒提取总RNA。

用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module(NEB,E7490)富集mRNA,以mRNA为模板,用NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina(NEB,E6110)和NEBNext Multiplex Oligos for Illumina(NEB,E7500)构建上机文库。

制备好的文库用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小,用Library Quantification Kit-Illumina GA Universal(Kapa,KK4824)进行QPCR定量。检测合格的文库在Illumina cbot上进行簇的生成,最后用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。利用de novo组装转录本,获得1kb以上的抗旱性相关Unigene 11187条。

利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)软件对上述Unigene做SSR分析,与NCBI数据库中的单子叶植物谷子、玉米、柳枝稷等的基因组序列进行比对,共筛选获得了5个含有五碱基核苷酸重复序列的Unigene,分别标记为RYW5、RYW6、RYW7、 RYW8、RYW32。五重复基序分别为(CCTTT)5、(ACACC)5、(CGCGC)5、(AATAG)5、(ATCTT)5,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1~SEQ ID No.5所示。

利用Primer5.0针对上述5个五碱基核苷酸重复序列设计前、后引物,引物设计参数见表1,引物对合成送上海生工生物工程技术服务有限公司。

以下给出了RYW5、RYW6、RYW7、 RYW8和RYW32五个位点的具体引物序列。

RYW5-F:5'-GACGATGCTCTTGACCTTGT-3'。

RYW5-R:5'-CACCGTGAAATGTCTCTGCT-3'。

RYW6-F:5'-AGCCGATTTGCTGTGGAGT-3'。

RYW6-R:5'-CTGCCTCCGATGAGTTGGT-3'。

RYW7-F:5'-TCCACTCATCCATTGCTCGT-3'。

RYW7-R:5'-GATGGATTCAAAGGGACGCT-3'。

RYW8-F:5'-GGGTCAGAGAATACACAGCG-3'。

RYW8-R:5'-GTAGGGAAGGAGAAGTGGGT-3'。

RYW32-F:5'-CAGGTTATGGGAGGACGAG-3'。

RYW32-R:5'-GGTGCTACGGTTACAGGGT-3'。

实施例2。

以来源于不同生态区的6个抗旱性黍子品种(表2)为试材,分析5个SSR标记的引物特征(等位变异大小和引物分辨率/Rp值)。

将所述6个试材种植在营养钵中,于三叶期剪取幼苗叶片,以改良CTAB法提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA质量,紫外微量核酸仪测定DNA的纯度和浓度。

以LifeEco基因扩增仪(TC-96/G/H(b)c,杭州博日科技有限公司)对上述DNA序列进行PCR扩增。

PCR反应体系:10×buffer(含25mmol/L Mg2+) 2μL,10mmol/L dNTP 1.8μL,5U/L Taq聚合酶 0.4μL,1mmol/L前后引物 各0.6μL,ddH2O 13.6μL,30ng/μL DNA模板 1μL,总计20μL。

PCR扩增程序:94℃ 5min;94℃ 45s,不同退火温度(RYW5-F:54.7℃,RYW5-R:55.6℃;RYW6-F:57.8℃,RYW6-R:56.4℃;RYW7-F:58.4℃,RYW7- R:58.9℃;RYW8-F:55.3℃,RYW8-R:56℃,RYW32-F:55℃,RYW32-R:54.7℃)退火50s,72℃ 1min,38个循环;72℃ 10min。

用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物,硝酸银染色显影,读取条带。等位变异长度用50bp DNA Marker(北京庄盟国际生物基因科技有限公司,北京)比对条带。

凝胶条带表示标记(>50bp)大小,相邻条带大小相差50bp。如果SSR标记在至少2份材料扩增出不同的DNA条带,则具有多态性。DNA条带代表等位变异,相同条带表示相同等位变异。

引物分辨率Resolving power(Rp)按照Prevost & Wilkinson方法计算:Rp=∑Ib。其中,Ib为某个等位基因信息量,p为某个等位基因在检测材料中出现的频率。

利用表2中来源于不同生态栽培区的6个抗旱性黍子品种,PCR扩增后,分析5个SSR标记的引物特征(等位变异大小和Rp值),结果见表3。从表3可以看出,五个标记的等位变异大小介于100~400bp,Rp值介于2.25~4,平均为3.1。

Rp值是衡量引物对不同基因型辨别能力的指标,直接关联标记信息。Rp值越高,遗传多样性越丰富。本发明五个抗旱性黍子特异性SSR引物的Rp值较高,分辨出不同基因型间存在的差异,可以作为鉴别种质资源间遗传差异的有效检测工具。

实施例3。

以来源于不同生态区的96个黍子品种(表4)为试材,利用五对SSR引物评估黍子资源的遗传多样性。

材料种植方法、叶片DNA提取、PCR扩增及电泳条带读取同实施例2。

遗传多样性评估指标(包括观测/有效等位基因数、观测/期望杂合度、基因多样性指数、多态性信息含量)用PowerMarker 3.25计算。

以五对引物扩增上述96份黍子种质资源,分析材料间的遗传差异,结果见表5。

从表5可以看出,五个位点共检测到15个等位变异,平均每个位点检测到的等位变异为3个;多态性信息含量介于0.5296~0.7281,平均为0.6030,高于以往研究结果(最高为0.49);基因多样性指数介于0.7717~1.0117,平均为0.8783,高于以往研究结果(最高为0.53)。说明96份黍子资源间存在丰富的遗传多样性,因此上述引物可以用来有效评估黍子资源的遗传多样性。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 用于检测黍子抗旱性遗传差异的五碱基重复基序分子标记

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 603

<212> DNA

<213> 黍子(Panicum miliaceum L.)

<400> 1

tacaaaacac gattattgag cttgcttgcc acatggcctt attcatcaaa gttttcccaa 60

gcgtccagct taacaatgaa tcattgttct aattggagcg tttatataga aacaagaaaa 120

aaaagacaga aaaaagagga ggtattgtca gcctttctac aacttgcttg ctacctgaac 180

ctacatctct ccttgataca ttttgcatct ggcgaacgag tgaactatct gtacatgctt 240

ctcctgtaaa aatcgaaaag ggatgccact ctttctcccc tttcctttcc tttcctttcc 300

tttctagaca ccacagctat tataagttac acaaacggac aaaaaggttg aagcagagac 360

atttcacggt gaaggctgtg tcacctcctg tcaaatatca gagctccacc tcgtgaagat 420

cctcacccaa accattgaac tgcagcgatg agttgctgct ggaacggctg tgcggaggca 480

ttttcccagg catcattggt gacggcatgg tctgtccatc gggtgatctg gaaacagcag 540

tgccgcccaa ctgctccggg tacgctccac tccatgacga tgctcttgac cttgacatcg 600

agc 603

<210> 2

<211> 325

<212> DNA

<213> 黍子(Panicum miliaceum L.)

<400> 2

acaccacacc acaccacacc acaccaaagc caagaaccaa ctcatcggag gcagagacca 60

caggcaggga aaaggcgacg aggggggagg agaaatcatg gagccgattt gctgtggaga 120

ttcggccgcg tgatccggtc ggatcttgct ttcctggggg gcgacggtgc tgccgtgccc 180

tgccatggtg gtcgcctcct attcctatat cctcctcctc cgtgctgctg cccccgagat 240

gccgcattag ccaccgctaa gcaacgccta cccccgttcc ccgcggccgc aaggaagaga 300

ccgacccagg cttctcttcc ctgag 325

<210> 3

<211> 439

<212> DNA

<213> 黍子(Panicum miliaceum L.)

<400> 3

gcgaataaaa acttttctag cgtccctttg aatccatcca tccatccact catccattgc 60

tcgtctccct cccaaattcg atgcctttgt agcgctgccg cttcgcccct gcgtcgcgcc 120

gcgccgcgcc gcgccgcgcc gtccagtccg cttgctgctg cgcttcccat ggacgccggg 180

gcgggtgccg gatccggcaa tgcctccggc ggcggcgcgt ccgcgtgctg ctactacgcg 240

ctgctcggca tccgcaagaa cgcctccgcc accgacatcc gcaccgccta ccggaggctc 300

gcgatgaagt ggcacccgga ccggtgggcg agcgacgccg gcgccgccgg cgaggccaag 360

cggcggttcc agcggatcca ggaggcctat tccgtcttgt cggacaaggg gaagaaggcc 420

atgtacgacg ccgggctct 439

<210> 4

<211> 625

<212> DNA

<213> 黍子(Panicum miliaceum L.)

<400> 4

ttaagggtca gataatacat agcaacttac acaagcgctc cagagtcctc cgctgcttct 60

catcacacag caataccaaa caacatgaaa atgtctaaca actcaccaca gcatctttcg 120

atgtcgattg ctcatgttga acaggggact tctgcttggc taggctgcca gcatttatag 180

ctggtggtgg aacctgccga cgcgtcgcgt ccatgtctga ccacccactt ctccttccct 240

cttcagtgcc tatgcaaatt tagcagacaa tcaaaactac atagaattcc ataggttgat 300

aatagaatag aatagaatag aataggatag gcactaacca gcaaaaacaa tcatttcatt 360

accacttgaa tgctttaaga tcataagggt cttggagtaa tgcaacacac aattaaagaa 420

gctaggatca cacaatataa ttagtttcta ccatcatgtc attactgtaa taattttgta 480

gctggaaacc tttttagaac tatatctaag tttcccaaag agtgatattt aatctgactc 540

agtggacgtt actaaccaaa aagataggta aattattgac aacctgcttg aaatttatct 600

tttcacaaaa gaaataggca gcaag 625

<210> 5

<211> 625

<212> DNA

<213> 黍子(Panicum miliaceum L.)

<400> 5

atttcttctt tttgttgttt catgggttct tctccggctc acatattttc cattctggat 60

tctgagaagt acaagctatg aggtattgtt gactttggat aaaaagaagc acaatttcga 120

cggtcctata tactattatg tgtttaactc ccttctattt tcactacttg ttctccacat 180

atattggtgg gttttaatat atcggatgct tgtgaggcaa atcatgacaa gaaatgttgg 240

agatgatgtt cgatctgact cagaaggaga agatgagcac gaagattgat tggcaccacc 300

atcttatctt atcttatctt atcttctgta ttgtaacgat gctacaagca tcgactccag 360

taccccaagc ttccgcattc ttttcctgga tttcaagata tgtgcaggtt atgggaggac 420

gagcattgtt cctcacgaga ttcatcggag ctgagctacg gtttcttctg cctcggccgc 480

acatctgtgt tgtaccatgt atgcatgata atacattgcg ctccagcgca ttaggagcag 540

ctggatatcg aagacaacat tcttttgggt gtaaactctg tagagagatg ttaagcttta 600

ccctgtaacc gtagcaccaa cgtgg 625

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gacgatgctc ttgaccttgt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

caccgtgaaa tgtctctgct 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

agccgatttg ctgtggagt 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ctgcctccga tgagttggt 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tccactcatc cattgctcgt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gatggattca aagggacgct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gggtcagaga atacacagcg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gtagggaagg agaagtgggt 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

caggttatgg gaggacgag 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ggtgctacgg ttacagggt 19

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