cfDNA捕获建库方法与流程

文档序号:14515067阅读:1244来源:国知局
本发明涉及一种基于iontorrent二代测序平台的dna捕获建库方法,属于生物
技术领域

背景技术
:新一代高通量基因检测技术,当今主要以illumina公司的hiseq,miseq系列和life公司的iontorrenttm系列测序仪为代表,有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病,针对肿瘤病人的治疗首选靶向治疗。由于肿瘤发病机制复杂,肿瘤细胞存在异质性,因此,同种癌种适合的靶向药会有所不同。针对同种癌种不同治,同一个病人不同时期不同治的要求,在用药前对病人进行靶点的全面筛查成为必要。高通量测序技术使更全面更精准的筛选用药靶点成功实现。二代测序技术中的靶向测序同样具有巨大优势,由于测序的区域小,可以对某些区域进行深度测序,使得低频突变的检测率大大提高。肿瘤关键基因较多,适合使用二代测序对某些关键的基因进行深度测序,得到肿瘤致病突变信息及相关用药靶点信息。然而,传统靶点筛查需要取到病灶组织,这极大的限制了高通量测序技术在该领域的应用。开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断,成为新的需求,其中,最为突出的是对病人cfdna进行检测是当前最具潜力的途径。由于cfdna中所含来自肿瘤细胞的ctdna往往使极微量的,因此,对检测灵敏度和准确度均提出了新的更高的要求。技术实现要素:本发明要解决的技术问题是提供一种能够实现高灵敏度、快速、低成本的二代文库构建的cfdna捕获建库方法。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种cfdna捕获建库方法,包括以下步骤:a.制作接头,对接头进行退火反应,纯化;b.对样本dna进行处理,进行末端补齐反应;c.末端补齐的dna片段进行加a反应;d.加a反应后的产物与接头进行连接反应;e.连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸;f.捕获延伸后的产物进行pcr扩增得到文库。上述接头是双链接头,由单链a和单链b组成,所述单链b包括从3’端至5’端依次设置的互补序列区域、任意碱基序列区域、样本barcode区域和ion接头a部分的序列;所述互补序列区域中包括与单链a的序列反向互补的序列。上述单链a序列的碱基个数为13~16个;所述互补序列区域的碱基个数为17~20个;所述任意碱基序列区域是12个随机碱基;所述样本barcode区域的碱基个数为6个;所述ion接头a部分的碱基个数为30~35个。上述单链a的核苷酸序列如seqidno.1所示,所述单链b的核苷酸序列如seqidno.2所示。上述单链a的5’端设有磷酸化修饰;所述单链b的5’端的至少三个碱基上设有硫代磷修饰。上述步骤e中,所述探针组包括15个探针,分别是核苷酸序列如seqidno.3所示的探针a,核苷酸序列如seqidno.4所示的探针b,核苷酸序列如seqidno.5所示的探针c,核苷酸序列如seqidno.6所示的探针d,核苷酸序列如seqidno.7所示的探针e,核苷酸序列如seqidno.8所示的探针f,核苷酸序列如seqidno.9所示的探针g,核苷酸序列如seqidno.10所示的探针h,核苷酸序列如seqidno.11所示的探针i,核苷酸序列如seqidno.12所示的探针j,核苷酸序列如seqidno.13所示的探针k,核苷酸序列如seqidno.14所示的探针l,核苷酸序列如seqidno.15所示的探针m,核苷酸序列如seqidno.16所示的探针n,核苷酸序列如seqidno.17所示的探针o。上述步骤e中的反应体系中包括连接反应的产物19体积,探针组溶液2体积,单条引物溶液2体积,缓冲液3体积,dntp溶液3体积,热启动酶0.3体积,纯水补足30体积;所述探针组中的各个探针在反应体系中的最终浓度均为1μm,所述单条引物在反应体系中的最终浓度为10μm。上述步骤e的反应条件是步骤一,在98℃,30min;步骤二,在98℃,20s,在65℃,15s,在72℃,30s,重复步骤二8次;步骤三,在72℃,5min;步骤四,保持在10℃。上述步骤e中,所述单条引物的核苷酸序列如seqidno.18所示。上述步骤f中采用上游引物和下游引物进行pcr扩增,所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.19所示,所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.20所示;所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为10μm。本发明具有积极的效果:(1)本发明的cfdna捕获建库方法关键步骤是连接反应的产物采用探针组和单条引物进行捕获延伸,一步完成,相较于现有的靶区域捕获方法,省去了杂交捕获的步骤,极大的节约了试剂成本;在捕获时避免了通用扩增,增加了靶区域产物量的比例,极大的缩短了建库时间;极大的减少了cfdna的损失,保证了样本的丰富程度。本发明的cfdna捕获建库方法基于iontorrent二代测序平台,最低可以检测出样本dna中0.01%的突变,满足了对cfdna中极少量突变ctdna检出的要求。(2)本发明的cfdna捕获建库方法采用的分子接头是一种双链线形接头,接头的其中一条单链长度较长,包括12个随机碱基序列、样本barcode和ion接头a部分,相对于普通接头,制作更为简单简洁,具有标记单个原分子的作用,能够识别不同样本的测序数据,较长的ion接头a部分适于用特异性探针进行捕获延伸,提高了检测低频突变的灵敏度和准确度。(3)本发明的cfdna捕获建库方法采用的分子接头包括磷酸化修饰和硫代磷修饰,5’端磷酸化有利于文库构建中与接头序列结合,硫代磷修饰有利于缓解环境中核酸外切酶的消化作用。附图说明图1是采用本发明实施例的建库方法通过igv测序数据可视化软件得到的突变分析结果图。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中,若非特意表明,所用的试剂均为分析纯,所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件,或按照制造商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。主要试剂:所有试剂购买自正规厂家,文库构建试剂包括:vahtstmnanodnalibraryprepkit(诺唯赞包括endprepmix、da-tailingmix、ligationmix、amplificationmix2,货号:602-02)、takarataqhs试剂(大连宝生物,货号:ac1401a)、ampurexpreagent磁珠(beckman)等。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与iontorrent二代测序平台相配套,包括pgmtemplateot2kit和ion316chip等部分。本方法实验前需要新鲜配制的试剂:75%乙醇(100%乙醇与无核酸酶水按3:1比例配制)。主要仪器:pcr仪(厂家:excellbio)、iontorrentpgm测序仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、磁力架、移液枪、pcr仪、震荡仪等。实施例本实施例的cfdna捕获建库方法包括以下具体步骤:a1.接头制作。本实施例的接头是双链线形接头,由单链a(seqidno.1)和单链b(seqidno.2)组成。接头退火前的核苷酸序列如下:5’-pgatcggaagagcgtc-3’3’-tctagccttctcgcagnnnnnnnnnnnntagcaatgcgactcagcctctgtgcgtccctactctac*c*a*a-5’其中,n代表任何一个碱基序列;*代表硫代磷修饰,p代表磷酸化修饰,能够在文库构建过程接头反应中与样本dna的3’端形成磷酸二酯键。单链a长度较短,单链b从3’端至5’端依次是开头的碱基t,与单链a的序列反向互补的ctagccttctcgcag,12个任意碱基序列,间隔的三个碱基tag,样本barcode的6个碱基caatgc,ion单链a部分的31的碱基,以及最后的2个碱基aa。a2.接头退火反应。将合成的接头采用1*te按照说明书溶解,稀释成浓度为100μm的工作液。将各取15μl的浓度为100μm的含单链a和b的工作液按1:1比例进行混合,加入3.3μl的10*pcr反应buffer中,加热到95℃,缓慢冷却到室温。a3.酚氯仿酒精沉淀纯化。1)在反应液中加入50μl的酚、氯仿和异戊醇混合液,上下颠倒并振荡后,12000rpm离心10分钟,取上清;2)加入50μl的氯仿,上下颠倒并振荡后,12000rpm离心10分钟,取上清;3)加入1μl的浓度为3m的naac溶液,加入300μl的-20℃无水乙醇;4)振荡混匀-20℃放置过夜,15000rpm离心10分钟;5)轻轻倒去上清,用移液枪小心吸掉上清残液,然后加入200μl的冰冻的浓度为70%乙醇水溶液;6)15000rpm离心5分钟;7)重复5)和6)步骤;8)轻轻倒去上清,用移液枪小心尽可能吸掉上清残液,10min晾干;9)加入30μl的1*te溶解;10)qiubit定量。b1.样本抽提。采用试剂盒(hipurecirculatingdnamidikit)提取肺癌患者血浆游离dna,具体的操作参见试剂盒产品说明书。抽提结束后用thermo-fisher核酸蛋白定量仪(nanodrop2000)测定样本浓度。b2.样本dna浓度测定。采用3.0对抽提后的dna浓度测定:1)向样本管加入1μl的qubitdsdnahsreagent和199μl的qubitdsdnahsbuffer,漩涡混匀4s;2)向已添加工作液的样品管内吸弃1μl的工作液,加入1μl的dna样本,漩涡混匀4s,每管的最终体积是200μl;3)所有管在室温避光孵育2分钟;4)在3.0主屏上点击“dna”键,然后选择dsdnahighsensitivity分析模式;5)把样本管放入3.0中,盖上盖子,点击read;6)选择calculateinitial初始浓度,然后选择volumeofsampleused:1μl,此时显示的结果为样本初始浓度,单位ng/μl;7)读取下一个样本:取出qubit3.0荧光光度计中样本。本发明中的检测样本为能提取核酸的任意形式的样品,包括但不限于:全血、血清、血浆和组织样品;组织样品包括但不限于:石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。若是组织样本,则需打断成片段(机械法或酶打断法),然后进行末端补齐反应。本实施例为cfdna样本直接进行末端补齐反应即可。b3.末端补齐反应。100μl的末端补齐反应的反应体系配比如下:12μl的endprepmix,20μl的本实施例的cfdna样本,ddh2o补足100μl。在pcr仪上30℃反应30min。反应后,磁珠纯化(1.5:1),20μl的h2o洗脱,quibit定量,参照步骤b2。c.加“a”反应。加“a”反应的反应体系配比如下:17.5μl的上一步的产物和12.5μl的da-tailingmix。在pcr仪上温度为37℃,反应30min,温度为70℃,再反应5min。此步产物直接进行下一步反应。d.连接反应。拿出switchsolution,室温混匀,漩涡充分混匀,瞬间离心2秒,反应体系如表1所示。表1连接反应的反应体系表将上述反应体系放入pcr仪内,pcr仪上温度为30℃,反应10min。反应结束在反应管中加入5μl的stopligationmix,使用移液器轻轻吹打混匀。使用pcr产物纯化磁珠(1.5:1)纯化产物,20μl的h2o洗脱,quibit定量。e.探针捕获延伸。探针组(probemix)根据肺癌人类基因的突变设计,为目的捕获区域的引物序列,且另一端为ion文库的p端序列,探针组包括15个探针。单条引物(primera1)为ion接头a部分同源序列,各探针和引物的核苷酸序列如表2所示。表2探针引物序列表名称sequence(5’—3’)seqno.探针attcctctctatgggcagtcggtgatctaagtcctgagcctgttttgtgtctact3探针bttcctctctatgggcagtcggtgatgctcaggacttagcaagaagttatggaattcct4探针cttcctctctatgggcagtcggtgatgaagtaaaaggtgcactgtaataatccagactgt5探针dttcctctctatgggcagtcggtgatgattctgaattagctgtatcgtcaaggcac6探针ettcctctctatgggcagtcggtgattttgaattcagtttccttcaagatcctcaagaga7探针fttcctctctatgggcagtcggtgatctgtgccagggaccttaccttataca8探针gttcctctctatgggcagtcggtgatagagtaaagtagatgatggaaatatacagcttgca9探针httcctctctatgggcagtcggtgataaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctat10探针ittcctctctatgggcagtcggtgatgcgtaaacgtccctgtgctaggtctt11探针jttcctctctatgggcagtcggtgattgagtacgtattttgaaactcaagatcgcattc12探针kttcctctctatgggcagtcggtgatgtactgggagccaatattgtctttgtgtt13探针lttcctctctatgggcagtcggtgatgatgcagagcttcttcccatgatgatct14探针mttcctctctatgggcagtcggtgatccttactttgcctccttctgcatggtattc15探针nttcctctctatgggcagtcggtgatgcatctcagggccaaaaatttaatcagtg16探针ottcctctctatgggcagtcggtgatagtatttctaagtatgatggaaaggttcagag17引物a1gcgtgtctccgactcag18用设计好的探针组合引物进行捕获延伸,反应体系如表3所示。表3探针延伸反应体系表探针捕获延伸的反应条件如表4所示。表4探针延伸反应条件表1.5倍磁珠纯化,30μl的dh2o洗脱。f.pcr扩增。pcr扩增所用引物对包括上游引物(primera2)和下游引物(primerp)。上游引物为ion接头a部分同源序列,上下游引物的核苷酸序列如表5所示。表5上下游引物序列表名称sequence(5’—3’)seqno.上游引物(primera2)ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag19下游引物(primerp)ccactacgcctccgctttcctctctatg20pcr扩增的反应体系如表6所示。表6扩增的反应体系表pcr扩增的反应条件如表7所示。表7pcr扩增的反应条件表反应结束后,1.5倍磁珠纯化,qiubit定量。获得的文库采用常规的方法进行上机测序。由测序的原始数据分析,得出on-target率、均一度等信息。部分数据如表8和表9所示。表8测序结果数据表(1)barcodenamesamplemappedreadsontaretmeandepthuniformityn22017072001138146480.02%1178888.41%表9测序结果数据表(2)barcodenamesamplebases≥q20basesreadsmeanreadlengthn2201707200116011451654717533589231102bp从上表中可以看出,采用本实施例的cfdna捕获建库方法获得的文库进行测序,灵敏度高,准确率高。通过igv测序数据可视化软件得到的突变分析结果图的一部分如图1所示,正常的人类基因组中基因位点碱基为t,多个测序结果显示,样本该位点的碱基为g,说明发生了突变。与现有技术相比具有明显的优势。本发明所用引物、探针由上海生工生物工程有限公司合成。上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。序列表<110>上海赛安生物医药科技股份有限公司<120>cfdna捕获建库方法<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>15<212>dna<213>人工序列(无)<400>1gatcggaagagcgtc15<210>2<211>69<212>dna<213>人工序列(无)<220><221>misc_feature<222>(42)..(53)<223>nisa,c,g,ort<400>2aaccatctcatccctgcgtgtctccgactcagcgtaacgatnnnnnnnnnnnngacgctc60ttccgatct69<210>3<211>54<212>dna<213>人工序列(无)<400>3ttcctctctatgggcagtcggtgatctaagtcctgagcctgttttgtgtctact54<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列(无)<400>4ttcctctctatgggcagtcggtgatgctcaggacttagcaagaagttatggaattcct58<210>5<211>59<212>dna<213>人工序列(无)<400>5ttcctctctatgggcagtcggtgatgaagtaaaaggtgcactgtaataatccagactgt59<210>6<211>55<212>dna<213>人工序列(无)<400>6ttcctctctatgggcagtcggtgatgattctgaattagctgtatcgtcaaggcac55<210>7<211>59<212>dna<213>人工序列(无)<400>7ttcctctctatgggcagtcggtgattttgaattcagtttccttcaagatcctcaagaga59<210>8<211>51<212>dna<213>人工序列(无)<400>8ttcctctctatgggcagtcggtgatctgtgccagggaccttaccttataca51<210>9<211>60<212>dna<213>人工序列(无)<400>9ttcctctctatgggcagtcggtgatagagtaaagtagatgatggaaatatacagcttgca60<210>10<211>56<212>dna<213>人工序列(无)<400>10ttcctctctatgggcagtcggtgataaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctat56<210>11<211>51<212>dna<213>人工序列(无)<400>11ttcctctctatgggcagtcggtgatgcgtaaacgtccctgtgctaggtctt51<210>12<211>58<212>dna<213>人工序列(无)<400>12ttcctctctatgggcagtcggtgattgagtacgtattttgaaactcaagatcgcattc58<210>13<211>54<212>dna<213>人工序列(无)<400>13ttcctctctatgggcagtcggtgatgtactgggagccaatattgtctttgtgtt54<210>14<211>53<212>dna<213>人工序列(无)<400>14ttcctctctatgggcagtcggtgatgatgcagagcttcttcccatgatgatct53<210>15<211>55<212>dna<213>人工序列(无)<400>15ttcctctctatgggcagtcggtgatccttactttgcctccttctgcatggtattc55<210>16<211>54<212>dna<213>人工序列(无)<400>16ttcctctctatgggcagtcggtgatgcatctcagggccaaaaatttaatcagtg54<210>17<211>57<212>dna<213>人工序列(无)<400>17ttcctctctatgggcagtcggtgatagtatttctaagtatgatggaaaggttcagag57<210>18<211>17<212>dna<213>人工序列(无)<400>18gcgtgtctccgactcag17<210>19<211>30<212>dna<213>人工序列(无)<400>19ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag30<210>20<211>28<212>dna<213>人工序列(无)<400>20ccactacgcctccgctttcctctctatg28当前第1页12
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