一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法与流程

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，将一种能够特异性延缓及减少芽孢生成的基因通过质粒或基因组重组的方式，在生产菌株中表达，以延长生产菌株的发酵周期，提高发酵菌株的生产效率。

背景技术：
：

芽孢杆菌生长迅速，发酵密度高，目前在工业/食品行业用酶发酵生产以及制药领域中有着举足轻重的地位；芽孢杆菌生产菌株主要包括枯草芽孢杆菌、解链淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌等，这些菌株顾名思义，在发酵后期，尤其是在高密度培养状态下，细胞会很快进入产芽孢的休眠体形式。在细胞变成芽孢休眠体后，发酵生产活动随即停止。因此，通常会在发酵过程中对培养液成份进行实时调控，以减缓芽孢的生成；此外，还常常通过对生产菌株进行遗传改造，通过人工诱变或基因敲除的方式将相关的转录因子(如sigf等)缺失，从而使生产菌株变成不能形成芽孢的微生物，但这种方式往往也有一些问题存在，一方面是由于芽孢生成是这类微生物固有的生命活动，对其进行强行缺失后会引发一些意想不到的微生物生理生化特性的改变，其结果是，这类生产菌株突变体在发酵生产时存在一定的缺陷，如细胞生物量很难提高，以及宿主细胞的分泌能力变弱等。

近年来，针对芽孢杆菌开展了全面的系统生物学的研究，并且随着芽孢杆菌操作改造效率的提高，许多种属相近的微生物的基因经平行遗传转入芽孢杆菌越来越频繁，芽孢杆菌性状的改变也因此更加快捷。

在本发明中，通过将多种其它来源的微生物基因库转入枯草芽孢杆菌164s中，发现其中编号为2367的基因在枯草芽孢杆菌的表达可明显降低该微生物形成芽孢的比率，并且生成芽孢的时间显著滞后，而其它生物特性没有改变，这一特征可以应用于对芽孢杆菌发酵生产菌株的改造。

技术实现要素：
：

本发明要解决的技术问题是提供一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，所述改造是通过在宿主细胞中表达调节基因a来完成的；

所述调节基因a为如下(a)、(b)或(c)所述的基因：

(a)其核苷酸为序列表seqidno.1所示的核苷酸序列(即基因2367)或其互补的核苷酸序列；

(b)其核苷酸为与(a)同源性高于90％，且编码具有相同生物学功能蛋白质的序列；

(c)其核苷酸为对(a)所述序列进行局部序列的取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且与(a)所编码蛋白质具有相同生物学功能的序列；

所述调节基因a的氨基酸序列如seqidno.2所示；

所述的改造是通过构建包含上述基因的质粒并转入宿主细胞，或在宿主基因组上整合了表达上述基因的遗传操作来完成；

所述芽孢杆菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解链淀粉芽孢等，其改造完成后，可以在高密度发酵过程中，明显减少并推迟芽孢的生成，因此可用于芽孢杆菌的外源蛋白或多肽类产品的发酵生产。

所述减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，通过构建包含上述基因的质粒并转入宿主细胞，具体如下：

(1)通过pcr的方式获得调节基因a，并将其构建到表达载体上得到重组载体；

优选地，所述表达载体为pmk4质粒；

进一步地，所述重组载体为pmk4-2367，核苷酸序列如seqidno.3所示；

(2)将重组载体在宿主细胞中进行表达获得重组菌株；

所述减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，通过在宿主基因组上整合表达上述基因，具体如下：

(1)合成线性dna片断amylre-2367；

(2)将amylre-2367在宿主细胞中表达，获得2367基因重组整合到了宿主细胞基因组中的重组菌株；

所述amylre-2367的核苷酸序列如seqidno.4所示。

有益效果：

利用本发明中所构建的芽孢杆菌进行长时间发酵，结果显示，表达了如seqidno.1所示的基因2367的芽孢杆菌，出芽孢的比例比对照枯草芽孢杆菌164s降低50％以上，且生成芽孢的时间滞后12小时以上，十分有利于在稳定期进行的工业发酵生产。

附图说明：

图1是带有基因2367的表达质粒pmk4-2367的质粒图；

图2是含有基因2367的线性dna片断amylre-2367的示意图；

图3是枯草芽孢杆菌164s、164s/pmk4-2367及164s/2367的发酵生长曲线；

图4是枯草芽孢杆菌164s、164s/pmk4-2367及164s/2367的芽孢镜检结果。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例中所用实验方法如非特别说明均为公知的常用微生物、生物化学或分子生物学技术；所用实验材料，除非特别说明，均购自商业公司。

其中，枯草芽孢杆菌164s是从美国atcc菌种保藏中心购得的，通常又被命名为atcc6051a。

实施例1质粒pmk4-2367的构建

所用质粒pmk4-p43-gfp是在pmk4的基础上构建而来，pmk4购自bgsc(bacillusgeneticstockcenter)，启动子p43经pcr和dna酶切连接，插入pmk4质粒上的psti/xmai位点之间，再将表达gfp的dna片断插入pmk4-p43质粒上的xmai/ecori位点之间，得到质粒pmk4-p43-gfp。然后，本实例通过融合pcr，将启动子p43、基因2367(seqidno.1所示序列)无缝连接，构建到pmk4中，得到质粒pmk4-2367(seqidno.3所示序列)。所构建的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

构建过程如下：

以引物2367-f(seqidno.5)和2367-r(seqidno.6)为引物，以含有基因2367的ta克隆质粒为模板，扩增获取基因2367；

以p43-f(seqidno.7)和p43-xmar(seqidno.8)为引物，以质粒pmk4-p43-gfp为模板，获得线性的质粒dna片段pmk4-p43；获得的pcr产物利用dpni处理，除去模板dnapmk4-p43-gfp。

pcr反应体系如下：

将上述获得的两种pcr产物以摩尔比1：1进行混合作模板，利用融合pcr方法进行两个片断的拼接，并转入大肠杆菌jm109。

融合pcr的标准程序如下：预变性98℃2min；变性98℃25s；退火50℃30s；延伸72℃，1kb/min，6个循环。pcr产物经axygenpcr清洁试剂盒回收纯化。

融合pcr反应体系如下：

实施例2表达基因2367的重组枯草芽孢杆菌的制备

表达基因2367的重组枯草芽孢杆菌有两种：

一种为质粒表达，即，将实施例1构建的质粒pmk4-2367转入高转化效率的枯草芽孢杆菌164s菌株中，得到菌株164s/pmk4-2367。

另一种重组杆菌也是基于枯草芽孢杆菌164s，但是利用了线性片断amylre-2367。图2所示的包含有基因2367的线性dna片段amylre-2367由四部分组成，分别带有用于枯草芽孢杆菌淀粉酶(amye)基因同源重组的片段amye-l及amye-r，和抗性基因ermc，amylre-2367的序列由seqidno.4所示，该长片段线线性dna由工生物工程(上海)股份有限公司化学合成，取100ng的dna片段用于枯草芽孢杆菌164s的转化。转化方法具体如下：

首先用无菌牙签将单菌落164s接种到装有3ml液体lb培养基的试管中，放在恒温振荡培养箱37℃、200r/min培养10～12h；取300μl转接到装有3ml预热的液体木糖培养基的试管中，每升木糖培养基含有20g木糖，10gnacl，10g蛋白胨，5g酵母膏，培养液放在恒温震荡培养箱中37℃、200r/min继续培养3h即制成164s的感受态细胞，然后分装500μl培养液到2ml离心管中；将amylre-2367加入装有感受态细胞的小离心管，用移液枪打匀，放到恒温振荡培养箱37℃、200r/min混合培养1.5h，涂到含10mg/l红霉素抗性的固体lb平板，放到37℃恒温箱过夜培养。

培养板上长出的阳性克隆再利用pcr方法进行鉴定，确定基因2367经基因重组整合到了枯草芽孢杆菌164s基因组中amye基因的位点，所获得的分子改造菌株命名为164s/2367。

实施例3枯草芽孢杆菌164s、164s/pmk4-2367及164s/2367的发酵培养及芽孢染色处理

枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵培养如下：

将枯草芽孢杆菌164s，164s/pmk4-2367以及164s/2367单克隆菌落分别接种到3mllb培养液，30℃、200r/min培养10h，然后以1％的体积比接种到含有50mllb培养基的500ml摇瓶中，30℃，200r/min连续培养，每3h取一次发酵液样品，绘制枯草芽孢杆菌164s，164s/pmk4-2367及164s/2367的发酵生长曲线图(图3)，由图看出，整合了基因2367的重组表达菌株164s/2367与原始菌株164s的生长曲线十分接近，而转入了表达质粒164s/pmk4-2367的生长生长略微缓于其余两株菌，那是由于红霉素抗性造成的。

在发酵后期，从发酵液样品中取20μl用于芽孢染色(参考schaeffer和fulton的染色方法)，具体如下：首先将20μl菌液涂载玻片，利用酒精灯进行烘烤固定；待载玻片冷却后加5％的孔雀绿染液，染色10min；水洗载玻片，直到流出水无绿色为止；加0.5％番红染液，复染2min后水洗载玻片，直到流出水为无色为止；水洗载玻片，用吸水纸吸干；油镜观察并拍照记录染色情况(见图4)，可见在同样的发酵时间点(54h)，表达了2367的重组菌的芽孢形成比例明显低下，形成芽孢的细胞占全部细胞的比例为20％以下，而对照164s的芽孢形成率约为50％。同时，其最早观察到芽孢的时间(36h)较164s(24h)生成芽孢的时间滞后12小时。

序列表

<110>山东隆科特酶制剂有限公司

<120>一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法

<130>1

<141>2017-12-12

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1203

<212>dna

<213>人工序列()

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