本发明涉及ssr引物,具体涉及一套基于黄秋葵转录组序列开发的ssr引物组及其应用,属于生物技术领域。
背景技术:
黄秋葵(hibiscusesculentusl.)别名羊角,原产于非洲东北部,世界各国均有栽培,中国主要在台湾和福建栽培。黄秋葵果实富含蛋白质、多种维生素、矿物质和丰富膳食纤维,同时还富含黄酮、多糖等成分。黄秋葵具有很高保健价值:它可保护视网膜,防止白内障的产生;可预防心血管疾病发生;能促进胃肠蠕动、防止便秘;可消除疲劳、迅速恢复体力,属营养保健蔬菜,有“天然植物黄金”之称,是多个国家运动员的首选蔬菜。黄秋葵种质资源丰富,分布地域广,栽培品种和变种较多,特别在印度、尼日利亚等国资源蕴藏丰富。据国际植物遗传资源委员会(ibpgr)报道,印度国家植物种质资源部保存有1806份资源,科特迪瓦收集保存2375份,尼日利亚拥有450份,美国保存有1688份。我国栽培黄秋葵的史悠久,早在明代的《本草纲目》中已有叙述,上世纪80年代,中国又从国外引进部分黄秋葵种质试种和扩繁成功,随后国内各科研单位积极引进国外优良品种,目前我国收集黄秋葵种质资源50多份,保存在中国热带作物研究院。我国黄秋葵育种发展时间较短,近几年各地才逐渐开始对黄秋葵种质资源进行收集和整理。由于缺乏大量的多态性分子标记,其遗传学和基因组学方面的研究比较滞后。因此,查清黄秋葵种质资源的遗传背景、开展相应的遗传学基础研究、定位重要经济性状是我国黄秋葵选育工作中首先需要解决的问题。
dna分子标记是鉴定种质资源遗传多样性的重要手段,其中微卫星序列(即简单重复序列simplesequencerepeat,ssr)分子标记被广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱建立等方面。est-ssr标记来源于dna序列的转录区,比基于基因组序列开发的ssr标记种间通用性更高,也更经济方便。目前黄秋葵ssr报道非常少,而分子标记的数量影响着种质资源遗传多样性分析的准确性和遗传图谱构建的精确性,现有的黄秋葵ssr分子标记数量远远不能满足黄秋葵分子生物学研究的需求,因此大量开发ssr标记仍是目前黄秋葵研究的重要工作之一。鉴于此,开发基于黄秋葵转录组序列的ssr引物组,将会对黄秋葵遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、dna指纹图谱构建、重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。
技术实现要素:
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一套基于黄秋葵转录组序列开发的ssr引物组及其应用。
本发明所述的基于黄秋葵转录组序列开发的ssr引物组,该ssr引物组有36对引物,分别为:
第1对引物,其序列如seqidno:1和seqidno:2所示;
第2对引物,其序列如seqidno:3和seqidno:4所示;
第3对引物,其序列如seqidno:5和seqidno:6所示;
第4对引物,其序列如seqidno:7和seqidno:8所示;
第5对引物,其序列如seqidno:9和seqidno:10所示;
第6对引物,其序列如seqidno:11和seqidno:12所示;
第7对引物,其序列如seqidno:13和seqidno:14所示;
第8对引物,其序列如seqidno:15和seqidno:16所示;
第9对引物,其序列如seqidno:17和seqidno:18所示;
第10对引物,其序列如seqidno:19和seqidno:20所示;
第11对引物,其序列如seqidno:21和seqidno:22所示;
第12对引物,其序列如seqidno:23和seqidno:24所示;
第13对引物,其序列如seqidno:25和seqidno:26所示;
第14对引物,其序列如seqidno:27和seqidno:28所示;
第15对引物,其序列如seqidno:29和seqidno:30所示;
第16对引物,其序列如seqidno:31和seqidno:32所示;
第17对引物,其序列如seqidno:33和seqidno:34所示;
第18对引物,其序列如seqidno:35和seqidno:36所示;
第19对引物,其序列如seqidno:37和seqidno:38所示;
第20对引物,其序列如seqidno:39和seqidno:40所示;
第21对引物,其序列如seqidno:41和seqidno:42所示;
第22对引物,其序列如seqidno:43和seqidno:44所示;
第23对引物,其序列如seqidno:45和seqidno:46所示;
第24对引物,其序列如seqidno:47和seqidno:48所示;
第25对引物,其序列如seqidno:49和seqidno:50所示;
第26对引物,其序列如seqidno:51和seqidno:52所示;
第27对引物,其序列如seqidno:53和seqidno:54所示;
第28对引物,其序列如seqidno:55和seqidno:56所示;
第29对引物,其序列如seqidno:57和seqidno:58所示;
第30对引物,其序列如seqidno:59和seqidno:60所示;
第31对引物,其序列如seqidno:61和seqidno:62所示;
第32对引物,其序列如seqidno:63和seqidno:64所示;
第33对引物,其序列如seqidno:65和seqidno:66所示;
第34对引物,其序列如seqidno:67和seqidno:68所示;
第35对引物,其序列如seqidno:69和seqidno:70所示;
第36对引物,其序列如seqidno:71和seqidno:72所示。
所述基于黄秋葵转录组序列开发的ssr引物组在鉴定黄秋葵亲缘关系和遗传特性中的应用。
本发明突出的效果是:1)本发明以提取的黄秋葵总dna为鉴定材料,在任何生长时期和部位取材都不影响反应结果;2)本发明的36对ssr引物多态性丰富,扩增稳定,重复性好,扩增条带清晰,具有简便、快捷、特异等特点;3)通过大量的筛选工作,得到了多态性的ssr引物组,进行黄秋葵多样性评价、亲缘关系分析、品种鉴定和品种权保护等提供分子水平上的依据,促进了黄秋葵遗传育种水平的提高和黄秋葵产业的发展。
附图说明
图1:引物hess20和hess033在32份黄秋葵种质资源中的多态性。m为dnamarker,a:hessr20,b:hessr033,1-32分别为表3所列的32份黄秋葵种质资源。
图2:基于36对黄秋葵ssr引物组对32份黄秋葵材料聚类分析。品种编号名称见表3。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
一、黄秋葵转录组数据来源
从福建省农业科学院作物研究所黄秋葵种质资源库中选取绿色黄秋葵资源(全株及嫩果均为绿色,果实6~8棱),花后6天的嫩果,液氮速冻,-80℃保存。测序时,每个单株构建1个文库。测序委托广州基迪奥生物科技有限公司采用illuminahiseqtm2500pe125系统进行rna-seq转录组测序(无参),采用trinity进行序列组装,经过滤获得3.87g的有效数据。
二、黄秋葵转录组中ssr的分布及结构特点
黄秋葵转录组经组装后共获得74600条unigene(序列总长约52976011bp),用misa软件对1kb以上的unigene(16257条,序列全长为26945574bp)进行搜索,发现其中3191条unigene序列中含有3448个ssr位点,其中235条unigene含有两个或两个以上的est-ssr位点。ssr发生频率为19.63%,出现频率为20.59%,平均7.81kb出现1个ssr,其中复合ssr有123个,占3.57%。ssr重复类型5种均有,即二核苷酸至六核苷酸重复。其中三核苷酸和二核苷酸重复出现频率占优势,分别占总ssr的60.79%、21.43%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少,分别占总数的8.93%、3.54%和5.31%(表1)。
黄秋葵转录组ssr重复单元的重复次数分布在4~26次之间,其中4~10次的ssr共有3358个,占总数的97.39%;其次为11~26次的ssr,共有90个,占总数的2.61%。黄秋葵转录组ssr的长度主要集中在12~256bp,其中长度在12~18bp的ssr达2504个,占总数的72.62%,长度在18bp以上的ssr有944个,只占27.38%。
表1黄秋葵ssr的类型、数量及分布频率
三、黄秋葵转录组中ssr基序重复类型和频率特征
黄秋葵转录组中3448个ssr位点共含181种重复基序,二核苷酸至六核苷酸重复分别有4、10、25、43和99种。从分布频率来看(表2),以三核苷酸重复类型aag/ctt出现最多,占总ssr的19.61%,占三核苷酸重复基序的总数的32.25%。其次是二核苷酸重复类型ag/ct,占总ssr的11.02%,占二核苷酸总数的51.42%。四核苷酸、五核苷酸尤其是六核苷酸重复基序分布较为分散,出现的频率较低。
表2黄秋葵转录中不同微卫星重复基序(motif)出现的频率
四、材料及其dna提取
用于ssr引物筛选和可用性评价的材料为福建省农业科学院作物研究所收集于亚蔬-世界蔬菜中心、中国热带作物研究院、福建省农业科学院蔬菜中心资源库的32份种质资源(表3)。基因组dna提取采用ctab法进行。
表3黄秋葵ssr多态性分析材料
五、黄秋葵ssr引物设计与筛选
使用misa程序(http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa)进行ssr位点搜索,以二至六核苷酸最少重复次数分别为6、5、5、4和4次为标准进行搜索。用primer3.0软件对ssr重复单元前后的序列进行引物设计及评价,每条ssr产生3条引物。引物序列长度18~27bp,gc含量40%~60%,退火温度57~63℃,上、下游引物的tm值相差≤2℃,预期扩增产物长度100~280bp;且无二级结构和二聚体。
含ssr位点的3191条unigene序列共设计出引物8088对。随机挑选100对不同重复单元(二、三、四、五、六核苷酸)的引物对黄秋葵‘hk08’dna进行ssr-pcr扩增以验证其有效性。结果表明100对引物实现有效扩增,有效率为100%,其中87对(87.00%)pcr扩增产物与预期大小相符,有13对(13.00%)扩增产物长度超过预期。
六、ssr引物组的有效性检验
从上述87对有效扩增引物中随机选取60对est-ssr引物对32份黄秋葵种质资源(表3)进行扩增及多态性评价。其中36对引物存在多态性差异(表4),占有效扩增引物的60.00%。每对引物产生的条带数在2~6之间,共得到147条条带,其中多态性片段102个,每对引物平均产生2.83个多态性片段。图1为引物hess20和hess033的扩增情况。36对多态性引物中二核苷酸重复的5对,三核苷酸重复的14对,五核苷酸重复的6对,六核苷酸重复的11对。
表436对黄秋葵ssr引物信息
36对多态性ssr引物对32份黄秋葵种质资源进行聚类分析,在遗传距离0.73处,供试材料被分成2大类(图2)。第1类包含28份种质资源,全部为含绿色果荚,在遗传距离0.39处,该类被分为4小类,果荚绿色的16、10、16、14、25、24、26、19、3、7、11、21、23、22、4、15和果荚绿白色的2、9、5、12、13聚在一起,均为原产亚非的资源种类;来自我国海南和福建的30、31、32聚为一类;原产美国的8、18聚为一类,原产澳大利亚的17成一类。第2类为果荚为红色的4份资源,27、28果荚为深红色,20、29果荚为红色。21、23的遗传距离为最近,均表现为植株较矮小,果荚浅绿色,果面茸毛细软,果无棱角,横断面近圆形。本研究结果表明,由黄秋葵转录组数据开发出的ssr标记可用性较高,为黄秋葵种质资源遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位及克隆及分子标记辅助育种等奠定了基础。
sequencelisting
<110>福建省农业科学院作物研究所
<120>基于黄秋葵转录组序列开发的ssr引物组及其应用
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