本发明属于酵母筛选
技术领域：
，涉及一种具有筛选红酵母作用的甲苯胺蓝o及其应用。
背景技术：
：类胡萝卜素是一种广泛存在于自然界中的红色、黄色或橘色的脂溶性色素，包括β-类胡萝卜素、虾青素、叶黄素和蕃茄红素等。类胡萝卜素作为前体物质可以生成多种具有重要生理功能的衍生物，如类维生素a、植物激素、色素及芳香类化合物等，具有增强机体免疫力、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和治疗光敏性疾病等重要作用，在食品、化妆品、医药和饲料等行业有着广泛的应用。类胡萝卜素的工业化生产方法主要包括化学合成法、植物提取法和生物发酵法。化学合成法技术复杂，合成的类胡萝卜素与天然的类胡萝卜素相去甚远，存在一定的副作用；植物提取法成本较高、工艺复杂，在工业化生产应用方面受到较大的限制；利用微生物发酵生产类胡萝卜素，成本低廉、工艺简单、安全高效，目前已成为生产类胡萝卜素的主要方法。cn104130952a公开了一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用，该发明对生产菌株进行多轮artp(常压室温等离子体)诱变，获得产量较高的诱变菌株，对类胡萝卜素和油脂的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益。然而artp诱变条件繁琐，成本较高，诱变后的菌株在自然条件下逐个培养单菌落，效率低下。因此，提供一种成本较低、操作方便、产率高的红酵母筛选方法，在类胡萝卜素生产领域具有重要意义。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种具有筛选红酵母作用的甲苯胺蓝o及其应用，采用甲苯胺蓝o进行红酵母的筛选，不仅提高了筛选效率，而且提高了红酵母的色素产量。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种甲苯胺蓝o作为筛选红酵母试剂的用途。甲苯胺蓝o(toluidineblueo，tbo)是一种在强光下产生氧负离子的光敏化试剂，主要用于组织染色，本发明中通过在红酵母的培养基中添加tbo，可以造成氧胁迫环境，只有高产类胡萝卜素的红酵母，才能快速生成菌落，显著提高了红酵母的筛选效率。优选地，所述甲苯胺蓝o的浓度为0.1-5mmol/ml，例如可以是0.1mmol/ml、0.5mmol/ml、1.0mmol/ml、1.5mmol/ml、2.0mmol/ml、2.5mmol/ml、3.0mmol/ml、3.5mmol/ml、4.0mmol/ml、4.5mmol/ml或5.0mmol/ml，优选为0.5-2mmol/ml，进一步优选为1-2mmol/ml。第二方面，本发明提供了一种筛选试剂，所述筛选试剂包括甲苯胺蓝o。第三方面，本发明提供了一种筛选红酵母的方法，采用如第二方面所述的筛选试剂，包括以下步骤：(1)使用添加有甲苯胺蓝o的液体培养基培养红酵母；(2)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，培养得到筛选后的红酵母。优选地，步骤(1)所述甲苯胺蓝o的浓度为0.1-5mmol/ml，例如可以是0.1mmol/ml、0.5mmol/ml、1.0mmol/ml、1.5mmol/ml、2.0mmol/ml、2.5mmol/ml、3.0mmol/ml、3.5mmol/ml、4.0mmol/ml、4.5mmol/ml或5.0mmol/ml，优选为0.5-2mmol/ml，进一步优选为1-2mmol/ml。优选地，步骤(1)所述液体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。优选地，步骤(1)所述培养的温度为25-30℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。优选地，步骤(1)所述培养的时间为22-25h，例如可以是22h、23h、24h或25h。优选地，步骤(1)所述培养时摇床的转速为180-220rpm，例如可以是180rpm、190rpm、200rpm、210rpm或220rpm。优选地，步骤(2)所述培养的温度为25-30℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。优选地，步骤(2)所述培养的时间为2-5天，例如可以是2天、3天、4天或5天。优选地，在步骤(1)之前还包括初筛和诱变的步骤。优选地，所述初筛和诱变具体包括：(1’)将活化的红酵母接种于液体培养基中进行培养，作为备诱变菌株；(2’)将步骤(1’)所述的备诱变菌株进行紫外灯照射，得到诱变红酵母。本发明中，在采用甲苯胺蓝o筛选红酵母前，对红酵母进行紫外照射，可以进一步提高红酵母生产类胡萝卜素的能力。优选地，步骤(2’)所述紫外灯的功率为30-50w，例如可以是30w、35w、40w、45w或50w。优选地，步骤(2’)所述紫外灯照射的时间为1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。作为优选技术方案，本发明提供了一种筛选红酵母的方法，采用如第二方面所述的筛选试剂，包括以下步骤：(1)将活化的红酵母接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中进行培养，作为备诱变菌株；(2)将步骤(1)所述的备诱变菌株在功率为30-50w的紫外灯下照射1-10min，得到诱变红酵母；(3)使用添加有0.5-2mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在25-30℃下培养步骤(2)所述的诱变红酵母22-25h，摇床的转速为180-220rpm；(4)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在25-30℃下培养2-5天，得到筛选后的红酵母。第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的方法筛选得到的红酵母。本发明中，筛选得到的红酵母的色素产量最高达5.027μg/ml，与野生红酵母相比产量提高了79.9％，采用筛选得到的红酵母用于工业化发酵生产类胡萝卜素，在类胡萝卜素生产领域具有重要意义。第五方面，本发明提供了一种如第四方面所述的红酵母用于发酵生产。优选地，所述红酵母用于发酵生产类胡萝卜素。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明在红酵母的培养基中添加甲苯胺蓝o，造成氧胁迫环境，能够快速高效地筛选出高产类胡萝卜素的红酵母；(2)本发明采用紫外诱变和甲苯胺蓝o共同配合，在紫外灯照射时间为5min，甲苯胺蓝o的浓度为1mmol/ml的条件下，筛选得到的红酵母的色素产量最高为5.027μg/ml，与野生红酵母相比色素产量提高了79.9％；(3)本发明的筛选方法工艺简单，成本较低，效率较高，可应用于类胡萝卜素的工业化生产。附图说明图1为筛选得到的红酵母实物图。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。材料：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心的粘红酵母(rhodotorulaglutinis)，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，保藏编号cicc31229，保藏日期为2005年10月28日。实施例1(1)将红酵母进行活化，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，28℃下200rpm培养2天，作为备诱变菌株；(2)将步骤(1)所述的备诱变菌株在功率为40w的紫外灯下照射5min，得到诱变红酵母；(3)使用添加有1mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在28℃下培养步骤(2)所述的诱变红酵母24h，摇床的转速为200rpm；(4)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在28℃下培养4天，得到筛选后的红酵母。实施例2(1)将红酵母进行活化，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，28℃下200rpm培养2天，作为备诱变菌株；(2)将步骤(1)所述的备诱变菌株在功率为40w的紫外灯下照射3min，得到诱变红酵母；(3)使用添加有1.5mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在28℃下培养步骤(2)所述的诱变红酵母24h，摇床的转速为200rpm；(4)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在28℃下培养4天，得到筛选后的红酵母。实施例3(1)将红酵母进行活化，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，28℃下200rpm培养2天，作为备诱变菌株；(2)将步骤(1)所述的备诱变菌株在功率为40w的紫外灯下照射7min，得到诱变红酵母；(3)使用添加有0.5mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在28℃下培养步骤(2)所述的诱变红酵母24h，摇床的转速为200rpm；(4)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在28℃下培养4天，得到筛选后的红酵母。实施例4(1)将红酵母进行活化，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，28℃下200rpm培养2天，作为备诱变菌株；(2)将步骤(1)所述的备诱变菌株在功率为50w的紫外灯下照射1min，得到诱变红酵母；(3)使用添加有2mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在28℃下培养步骤(2)所述的诱变红酵母24h，摇床的转速为200rpm；(4)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在28℃下培养4天，得到筛选后的红酵母。实施例5(1)将红酵母进行活化，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，28℃下200rpm培养2天，作为备诱变菌株；(2)将步骤(1)所述的备诱变菌株在功率为30w的紫外灯下照射10min，得到诱变红酵母；(3)使用添加有0.1mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在25℃下培养步骤(2)所述的诱变红酵母25h，摇床的转速为220rpm；(4)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在25℃下培养5天，得到筛选后的红酵母。实施例6(1)将红酵母进行活化，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，28℃下200rpm培养2天，作为备诱变菌株；(2)使用添加有5mmol/ml甲苯胺蓝o的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在30℃下培养步骤(1)所述的备诱变菌株22h，摇床的转速为180rpm；(3)将红酵母悬液涂布于固体培养基上，在30℃下培养2天，得到筛选后的红酵母。对比例1与实施例1相比，诱变红酵母不采用甲苯胺蓝o进行筛选，其他方法与实施例1相同。对比例2与实施例1相比，甲苯胺蓝o的浓度为7mmol/ml，其他方法与实施例1相同。对比例3与实施例1相比，紫外灯照射的时间为15min，其他方法与实施例1相同。对比例4与实施例1相比，紫外灯的功率为20w，其他方法与实施例1相同。对比例5与实施例1相比，紫外灯的功率为70w，其他方法与实施例1相同。色素产量的测定将实施例、对比例和野生的红酵母，接种于ypd平板上传10代，28℃下培养4天，用ypd液体培养基调整培养液的od600值，取10ml菌液，8000rmp离心10min弃上清，加入20ml浓度为3mol/l的浓盐酸，40℃水浴60min，沸水浴处理4min，放入-20℃冰箱中速冷，离心后使用蒸馏水水洗两次，加入10ml丙酮，40℃水浴振荡30min，取含有色素的丙酮上清液，测量200-600nm处的最大吸光度，根据以下公式计算色素产量，其中，a表示最大吸光度，v表示提取色素时加入的丙酮的体积(ml)，d表示样品的稀释倍数，0.16为类胡萝卜素消光系数，l表示发酵液的体积(ml)。色素产量(μg/ml)＝a×v×d/0.16×l色素含量＝色素产量/生物量结果见图1和表1，红酵母在ypd培养基上形成红色菌落。表1编号色素产量(μg/ml)提高率(％)实施例15.02779.9实施例24.60064.6实施例33.84537.6实施例43.78135.3实施例53.51625.8实施例63.12311.8对比例12.8261.14对比例23.11511.49对比例33.22715.50对比例43.25216.39对比例53.15612.96野生红酵母2.794-由此可见，实施例1-6的红酵母的色素产量均高于3μg/ml，与野生红酵母相比，色素产量提高了10％以上，其中，实施例1采用最佳的紫外灯照射时间5min，最优的甲苯胺蓝o浓度1mmol/ml，筛选得到的红酵母的色素产量高达5.027μg/ml，与野生红酵母相比色素产量提高了79.9％，实施例6与其他实施例对比，未经紫外诱变而直接采用甲苯胺蓝o进行筛选，得到的红酵母的色素产量与野生红酵母相比提高了11.8％，说明甲苯胺蓝o可以提高红酵母的色素产量，但是红酵母经紫外诱变后再进行甲苯胺蓝o筛选，能够进一步提高色素产量。与实施例1相比，对比例1的红酵母不采用甲苯胺蓝o进行筛选，得到的红酵母的色素产量基本没有提高；对比例2的甲苯胺蓝o的浓度过高，对红酵母具有毒性作用，影响了色素产量；对比例3的紫外灯照射时间过长，不仅影响了筛选效率，而且对红酵母具有一定的副作用，红酵母的有益突变减少；对比例4-5的紫外灯功率不在合理范围内，一定程度影响了红酵母的色素产量。综上所述，本发明通过在红酵母的培养基中添加甲苯胺蓝o，造成氧胁迫环境，能够快速高效地筛选出高产类胡萝卜素的红酵母，紫外诱变和甲苯胺蓝o相互配合，在紫外灯照射时间为5min，甲苯胺蓝o的浓度为1mmol/ml的条件下，筛选得到的红酵母的色素产量最高为5.027μg/ml，与野生红酵母相比色素产量提高了79.9％。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12