饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及饲料中沙门氏菌的微滴数字pcr检测方法。
背景技术：
：微滴数字pcr（ddpcr）是近年来发展起来的可以定量检测dna的新方法，通过pcr扩增和荧光信号的积累读取阳性微滴数目。微滴式数字pcr系统在传统的pcr扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经pcr扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。该方法不需要核酸标准品，又兼具qpcr的优势。开发了高灵敏，高选择性的检测饲料中性致病菌的新方法。沙门氏菌是常见的食源性病原菌。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它能引起人和动物很多重大疾病，其广泛存在于自然界中。沙门氏菌传播途径多，比如肉、蛋及食品运输等过程中的感染。肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20%~25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%，国内肉类沙门氏菌检出率在1.1%~39.5%；中国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9%~43.7%，由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势；食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。传统培养法是目前常用检测方法，但其检验沙门氏菌程序复杂，全过程4-7天才能得出明确结果。因此建立一种溯源技术来排查饲料污染，控制饲料安全的关键环节具有重要意义。确定饲料中致病菌在食物链中相关的食品，寻找预防食品污染的关键环节，具备对突发事件的反应能力，建立和完善食源性致病菌及食源性疾病的监测系统和预警系统。微滴数字pcr技术可以弥补食源性病原菌上的应用的不足。技术实现要素：本发明目的是为解决传统方法检测沙门氏菌费时、复杂等问题，而提供一种方便、快速的饲料中沙门氏菌的微滴数字pcr检测方法。饲料中沙门氏菌的微滴数字pcr检测方法，包括以下步骤：1）称取25g沙门氏菌样品至盛有225ml无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；沙门氏菌样品的增菌培养按照gb4789.4进行；非目标菌株增菌采用lb培养液在36℃下培养20-30h；获得样品及对照组的增菌液；2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的dna；3）获得鉴定沙门氏菌的pcr扩增引物及探针引物；4）将步骤2）所得dna进行微滴数字pcr扩增，获得反应液；所述的微滴数字pcr反应体系为20μl，各成分含量为：2×ddpcr预混液10μl，上下游引物（10µmol/l）各1μl，探针引物（10µmol/l）1μl，模板dna4μl，双蒸水3μl；反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；体系完成后，进行数字pcr反应；5）对步骤4）的反应液进行检测与分析。步骤3）中所述的鉴定沙门氏菌的pcr扩增引物及探针引物，包括：沙门氏菌引物正向序列：5＇-gcggcgttggagagtgata-3＇，反向序列；5＇-agcaatggaaaaagcaggatg-3＇；探针序列：5＇-fam-catttcttaaacggcggtgtctttccct-tamra-3＇；步骤1）中所述的非目标菌株为：产气荚膜梭菌（atcc13124）、粪链球菌（atcc29212）、金黄色葡萄球菌（atcc26001）、肠出血性大肠艾希氏菌o157:h7（jl08038）、单核细胞增生李斯特菌（atcc19111）；培养时间为24h；步骤2）中所述的提取，具体包括以下步骤：取增菌液，8000r/min离心5min，弃上清液，加入500μlctab、40μl蛋白酶k，震荡均匀，65℃温浴30min；加入500μl三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10min；弃上清液，用预热至65℃te缓冲液溶解dna；加入5μlrna酶溶液，37℃温浴30min；加入200μl三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10min；弃上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀dna，12000r/min离心1min；弃上清液，干燥，加50μl预热至65℃te缓冲液溶解dna。本发明提供了鉴定沙门氏菌的pcr扩增引物及探针引物，包括：沙门氏菌引物正向序列：5＇-gcggcgttggagagtgata-3＇，反向序列；5＇-agcaatggaaaaagcaggatg-3＇；探针序列：5＇-fam-catttcttaaacggcggtgtctttccct-tamra-3＇；一种饲料中沙门氏菌的微滴数字pcr检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225ml无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养，得到增菌液；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的dna；获得鉴定沙门氏菌的pcr扩增引物及探针引物；将所得dna进行微滴数字pcr扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析。结果表明该引物对沙门氏菌的扩增具有特异性；同时微滴数字pcr对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为108-103的基因序列进行检测，灵敏度良好。本发明的检测方法，其克服传统致病微生物检测方法的诸多不便，为食源性病原菌检测开辟了新的
技术领域：
。附图说明图1沙门氏菌特异性实验微滴生成情况柱形图；图2沙门氏菌特异性实验散点图；图3沙门氏菌重复性实验微滴生成情况柱形图；图4沙门氏菌重复性实验散点图；图5沙门氏菌灵敏性实验微滴生成情况柱形图；图6沙门氏菌灵敏性梯度散点图。具体实施方式实施例1饲料中沙门氏菌的微滴数字pcr检测方法1、增菌培养称取25g沙门氏菌样品至盛有225ml无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成重量比为1:10的样品匀液。沙门氏菌样品的增菌培养按照gb4789.4进行；非目标菌株增菌采用lb培养液在36℃下培养24h。获得样品及对照组的增菌液。所述的非目标菌株如下：产气荚膜梭菌（atcc13124）、粪链球菌（atcc29212）、金黄色葡萄球菌（atcc26001）、肠出血性大肠艾希氏菌o157:h7（jl08038）、单核细胞增生李斯特菌（atcc19111）。2、细菌模板dna的提取对于上述方法培养的增菌液，取增菌液1ml均加到一个1.5ml无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清液，加入500μlctab、40μl蛋白酶k，震荡均匀，65℃温浴30min；加入500μl三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10min；弃上清液，用预热至65℃te缓冲液溶解dna（te量视dna沉淀的多少而定）；加入5μlrna酶溶液，37℃温浴30min；加入200μl三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10min；弃上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀dna，12000r/min离心1min；弃上清液，干燥，加50μl预热至65℃te缓冲液溶解dna。（如不能及时检验，可将上清液于-20℃保存）。也可使用细菌基因组dna提取试剂盒并按其说明提取制备模板dna。如不能及时检验，提取的dna可于-20℃保存。3、pcr扩增反应1）引物和探针的序列如下：上游引物-5＇-gcggcgttggagagtgata-3＇下游引物-5＇-agcaatggaaaaagcaggatg-3＇探针-5＇-fam-catttcttaaacggcggtgtctttccct-tamra-3＇将得到如下的反应体系和扩增参数：（本实验采用bio-rad公司生产的微滴数字pcr耗材及试剂。）微滴数字pcr反应体系如下表1：表1试剂成分体积（µl）2×ddpcr预混液10上游引物（10µmol/l）1下游引物(10µmol/l）1探针(10µmol/l）1模板dna（1~100ng/μl）4双蒸水32）微滴数字pcr反应程序反应条件：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物。体系完成后，进行数字pcr反应。荧光分析步骤采用fam单荧光通道。4、检测方法1）微滴数字pcr扩增的特异性实验添加沙门氏菌的同时添加金黄色葡萄球菌（atcc26001）、单核细胞增生李斯特菌（atcc19111）、肠出血性大肠艾希氏菌o157:h7（jl08038）、粪链球菌（atcc29212）、产气荚膜梭菌（atcc13124）、用该方法进行检测，该方法能够检出添加的沙门氏菌。实验结果见图1、图2。结果表明上述引物对沙门氏菌的扩增具有特异性。2）微滴数字pcr扩增的重复性实验本研究设定9次重复对沙门氏菌进行重复性实验（见图3、图4），表明微滴数字pcr对其扩增稳定，实验数据可信。3）微滴数字pcr扩增的灵敏度实验将测得浓度为108的dna溶液按照10倍浓度依次稀释，取浓度为108-103的基因序列进行检测，每个梯度设置三个重复，其结果见图5及图6。5、微滴数字pcr本底实验本实验采用羽毛粉、鱼粉、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、喷浆玉米皮、配合饲料、预混合饲料、鸡浓缩饲料、小猪浓缩饲料、羔羊精料，10种常见饲料产品进行本底实验，每种平行3次，进行本底实验。取样方法依照gb/t14699.1《饲料采样方法》的相关规定，在无菌条件下对饲料进行取样并均质。经实验验证均未检出沙门氏菌。当前第1页12