一种检测细胞源病毒抗原液的分离纯化效果的方法与流程

文档序号:14468331

本发明涉及抗原纯化领域,具体而言,涉及一种检测细胞源病毒抗原液的分离纯化效果的方法。



背景技术:

疫苗(vaccine),是指将病原微生物(如细菌、病毒等)及其代谢产物,经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。目前,疫苗已经成为人类主动防御各种传染病的最重要手段之一。

病毒是专营宿主细胞内寄生型微生物,因此,除少量基因工程疫苗外,现阶段制备疫苗制剂用病毒主要通过大规模培养动物或植物细胞并接种病毒,最终收集细胞裂解后释放至培养基中的病毒的方式生产获得。

然而,生产结束后,细胞培养基中不但包括可用作疫苗的病毒,还包括细胞破裂释放病毒时形成的细胞残骸和胞内大颗粒物质等,如果不纯化处理而直接用于制备疫苗,不但免疫效果不佳,而且对动物和人体存在诸多安全风险。因此,有必要对收获的培养基进行分离纯化。而如何快速、有效地检测培养基的纯化效果,对判定纯化操作的停止节点、评价纯化操作的有效性、以及评估疫苗的质量具有极为重要的意义。

现有对抗原纯化效果的检测方法主要有两种:

(1)通过凯氏定氮法测定样品液中总蛋白的含量,从而大致估计样品中病毒抗原的纯化效果;(2)通过肉眼观察样品液的澄清度判断样品液的离心效果。

而无论是凯氏定氮法还是肉眼观察法在评估病毒抗原纯化效果方面都存在较大的缺陷。首先,凯氏定氮法是一种比较复杂的滴定方法,需要专门的实验室进行检测,检测过程长,不利于在生产现场快速地对抗原纯化效果进行判断,无法实现在生产过程中实时监测,无法有效保证抗原质量;而且凯氏定氮法比较繁琐,涉及到硫酸、硼酸、盐酸等危险化学品,容易对人员造成安全威胁。其次,肉眼观察澄清度的方法,主观性太强,因人而异,误差大。

有鉴于此,特提出本发明。



技术实现要素:

本发明的第一目的在于提供一种检测细胞源病毒抗原液的分离纯化效果的方法,所述方法能够相对而言较为准确地对病毒抗原的分离效果进行评估,满足疫苗生产需要,具有快速、简单、实时、性价比高的优点。

为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:

一种检测细胞源病毒抗原液的分离纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)取经过分离纯化后的细胞源病毒抗原液,对所述细胞源病毒抗原液进行浊度定量检测,记为A值;

(2)如果A值≤90NTU,则所述细胞源病毒抗原液的分离纯化效果合格;若A值>90NTU,则所述细胞源病毒抗原液的分离纯化效果不合格,继续分离纯化操作,并检测A值,直至A值≤90NTU。

具体实施方式

一种检测细胞源病毒抗原液的分离纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)取经过分离纯化后的细胞源病毒抗原液,对所述细胞源病毒抗原液进行浊度定量检测,记为A值;

(2)如果A值≤90NTU,则所述细胞源病毒抗原液的分离纯化效果合格;若A值>90NTU,则所述细胞源病毒抗原液的分离纯化效果不合格,继续分离纯化操作,并检测A值,直至A值≤90NTU。

本发明所述方法通过定量检测浊度的方式评估细胞源病毒抗原液的分离纯化效果,所述方法依托于抗原液浊度与杂蛋白之间的关联度直接建立。与常规的凯氏定氮法相比,本发明所述方法中的浊度与纯化效果之间的关联性更直接、更准确;而与肉眼观察法相比,本发明所述方法为定量检测,其准确性更高。尤为重要的是,本发明所述方法提供抗原液浊度与病毒抗原纯化效果之间的直接判定标准,即A值是否大于90NTU,该判定标准的确定既考虑疫苗生产过程中对病毒抗原纯度要求,又兼顾生产过程中对生产成本的控制,满足本发明所述方法的细胞源病毒抗原液可直接用于疫苗生产,同时,其还具有制备成本低、性价比高的优点。

为减少工作人员的工作量以及人为操作的误差,在一些具体的实施方式中,所述浊度通过浊度计进行自动检测。

在一些具体的实施方式中,所述分离纯化的方式为离心或者过滤;

优选地,所述分离纯化方法为离心;

更优选地,所述离心使用的离心机为连续流离心机,可以在离心分离的同时对分离的上清液实施实时浊度检测,从而准确地判断离心纯化分离的终点;

更优选的,在分离纯化过程中,所述离心机的转速为12000~17000rpm/min;

最优选地,在分离纯化过程中,所述离心机的转速为15000rpm/min。

在一些具体的实施方式中,所述病毒抗原选自下组中的一种或多种:

流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病毒、传染性贫血症病毒、Gumboro病病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、细小病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒;

优选地,所述病毒抗原为流感病毒,所述流感病毒选自禽流感病毒、猪流感病毒或人流感病毒;

更优选地,所述流感病毒为禽流感病毒,所述禽流感病毒选自H1亚型、H2亚型、H3亚型、H4亚型、H5亚型、H6亚型、H7亚型、H8亚型、H9亚型、H10亚型、H11亚型、H12亚型、H13亚型或H14亚型;

最优选地,所述禽流感病毒为H7N9H7-Re1株。

在一些具体的实施方式中,用于生产所述细胞源病毒抗原的细胞为CHO细胞、MDCK细胞或Vero细胞;

优选地,用于生产所述细胞源病毒抗原的细胞为MDCK细胞。

在一些具体的实施方式中,为促进细胞的破裂从而进一步释放病毒抗原,本发明所述方法还包括在分离纯化前对所述细胞源病毒抗原进行预处理的步骤,所述预处理包括对所述细胞源病毒抗原液进行冻融和/或超声波处理。

在一些具体的实施方式中,所述方法还包括以下步骤:

为进一步分离细胞源病毒抗原液中的小颗粒杂质,当所述细胞源病毒抗原液的浊度符合要求后,使用中空纤维微滤系统对所述细胞源病毒抗原液进行过滤处理。

在一些具体的实施方式中,所述中空纤维微滤系统包括中空纤维柱膜;

优选地,所述中空纤维柱的膜孔径大小为0.45~1.0μm,例如,所述中空纤维柱的膜孔径大小为0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.55μm、0.6μm;

所述中空纤维柱的数量为5~8个,例如所述中空纤维柱的数量为5个、6个、7个或8个。

在一些具体的实施方式中,所述方法还包括以下步骤:

为了使所述病毒抗原液的浓度符合制备疫苗的要求,当所述细胞源病毒抗原液的浊度符合要求后,使用膜包超滤系统对所述细胞源病毒抗原液进行浓缩处理。

在一些具体的实施方式中,所述膜包超滤浓缩系统的膜孔径为300~750KD,所述膜包数量为10~18块,例如,所述膜孔径为300KDa、350KDa、400KDa、450KDa、500KDa、550KDa、600KDa、650KDa、700KDa或750KDa,所述膜包数量为10块、11块、12块、13块、14块、15块、16块、17块或18块。

与现有技术相比,本发明的有益效果为:

(1)本发明所述方法能够相对而言较为准确地对病毒抗原的分离效果进行评估,满足疫苗生产需要,具有快速、简单、实时、性价比高的优点;

(2)本发明所述方法可以采用浊度计进行自动化检测,减少人员工作量,同时避免人工误差;

(3)本发明所述方法可以采取连续流离心机进行分离纯化,可以在离心分离的同时对分离的上清液实施实时浊度检测,从而准确地判断离心纯化的终点;

(4)本发明所述方法还包括使用中空纤维微滤系统对所述细胞源病毒抗原液进行过滤处理以及使用膜包超滤系统对所述细胞源病毒抗原液进行浓缩处理,可以进一步提高抗原的纯度和浓度,从而提高疫苗的质量。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

一种分离纯化禽流感病毒并评价其纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)将待分离纯化的重组禽流感病毒H7N9H7-Re1株(细胞源)进行反复冻融,之后,低温静置沉淀,抽取上清液;

(2)使用连续流离心机对所述上述上清液进行离心处理,转速为12000rpm/min;

(3)在连续离心的同时,通过浊度计检测离心后液体的浊度,如果浊度大于90NTU,则将离心后的上清液再次进行离心处理,直至离心后的液体浊度小于90NTU。

实施例2

一种分离纯化禽流感病毒并评价其纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)将待分离纯化的重组禽流感病毒H7N9H7-Re1株(细胞源)进行反复冻融,之后低温静置沉淀,抽取上清液;

(2)使用连续流离心机对所述上述上清液进行离心处理,转速为15000rpm/min;

(3)在连续离心的同时,通过浊度计检测离心后液体的浊度,如果浊度大于80NTU,则将离心后的上清液再次进行离心处理,直至离心后的液体浊度小于80NTU。

实施例3

一种分离纯化禽流感病毒并评价其纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)将待分离纯化的重组禽流感病毒H7N9H7-Re1株(细胞源)进行反复冻融,之后低温静置沉淀,抽取上清液;

(2)使用连续流离心机对所述上述上清液进行离心处理,转速为17000rpm/min;

(3)在连续离心的同时,通过浊度计检测离心后液体的浊度,如果浊度大于70NTU,则将离心后的上清液再次进行离心处理,直至离心后的液体浊度小于70NTU。

实施例4

一种分离纯化禽流感病毒并评价其纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)将待分离纯化的重组禽流感病毒H7N9H7-Re1株(细胞源)进行反复冻融,之后低温静置沉淀,抽取上清液;

(2)使用连续流离心机对所述上述上清液进行离心处理,转速为15000rpm/min;

(3)在连续离心的同时,通过浊度计检测离心后液体的浊度,如果浊度大于80NTU,则将离心后的上清液再次进行离心处理,直至离心后的液体浊度小于80NTU;

(4)离心结束后用中空纤维微滤系统处理离心后得到的上清液,其中,所述中空纤维微滤系统由8个中空纤维膜柱组成,所述8个中空纤维膜的孔径为0.8μm。

实施例5

一种分离纯化禽流感病毒并评价其纯化效果的方法,所述方法包括以下步骤:

(1)将待分离纯化的重组禽流感病毒H7N9H7-Re1株(细胞源)进行反复冻融,之后低温静置沉淀,抽取上清液;

(2)使用连续流离心机对所述上述上清液进行离心处理,转速为15000rpm/min;

(3)在连续离心的同时,通过浊度计检测离心后液体的浊度,如果浊度大于80NTU,则将离心后的上清液再次进行离心处理,直至离心后的液体浊度小于80NTU;

(4)离心结束后用中空纤维微滤系统处理离心后得到的上清液,其中,所述中空纤维微滤系统由8个中空纤维膜柱组成,所述8个中空纤维膜的孔径为0.8μm;

(5)收集由中空纤维微滤系统处理后的透过液,使用膜包超滤系统对所述透过液进行浓缩处理,所述膜包的膜孔径为600KDa,膜包数量为10块。

对比例1

同实施例2,区别仅在于,离心机的转速为5000r/min,当上清液的浊度小500NTU时,停止离心。

对比例2

同实施例2,区别仅在于,离心机的转速为10000r/min,当上清液的浊度小200NTU时,停止离心。

实验例1

检测实施例1~5以及对比例1~2所述重组禽流感病毒在离心之后的浊度和杂蛋白的去除率,其中杂蛋白的去除率通过高效液相色谱检测检测。具体检测结果如表1所示。

根据表1所示检测结果可知,离心之后上清液浊度与杂蛋白去除效率之间存在明显的对应关系,其中,上清液的浊度与低,杂蛋白的去除率越高。当上清液的浊度在70~90NTU时,杂蛋白的去除率达到70~90%,满足病毒抗原用于制备疫苗的要求。

表1不同方法的纯化结果

最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

再多了解一些
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