牛双芽巴贝斯虫的Real-timePCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法与流程

文档序号:14468319阅读:483来源:国知局
牛双芽巴贝斯虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法与流程

本发明具体涉及生物学技术领域,具体涉及一种牛双芽巴贝斯虫的real-timepcr特异性引物和探针及检测试剂盒与real-timepcr检测方法。



背景技术:

牛双芽巴贝斯虫是一类经蜱传播,红细胞内寄生的血液原虫,由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病,是一种急性过程的季节性疾病,在世界上许多地区发生和流行,我国各地也常有发生,给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后,常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状,严重影响牛的健康。该病已经造成了巨大的经济损失,并呈世界范围扩大趋势,因而引起国内外学者的广泛关注。牛双芽巴贝斯虫是经蜱传播的一种血液原虫,寄生于哺乳动物红细胞、淋巴细胞和其他细胞中,也可以寄生在蜱的各种组织细胞中。双芽巴贝斯虫寄生于黄牛、奶牛、水牛和瘤牛的红细胞内,由微小牛蜱(boop-hilusmicroplus)、无色牛蜱(b.decoloratus)、环形牛蜱(b.annulatus)等多种蜱,经卵传播。双芽巴贝斯虫的临床诊断最基本的方法是血液涂片镜检,但是该方法只能用于对发病牛的检测,但对疫病普查和进出口检疫则有困难,因为发病牛只痊愈后很难查到虫体。血清学检查也是牛双芽巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法,但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过,不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。敏感性更高的方法,例如常规pcr检测技术也是诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫最常用的方法,但是该方法具有很大的一个缺点-低特异性,扩增时容易产生假阳性。而且在检测牛双芽巴贝斯虫的过程中发现,牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性和特异性更高的方法,例如反向线性斑点杂交技术(rbl)以及pcr-elisa等也已经见诸于报道,但是这些方法都存在假阳性率高的缺点。

real-timepcr是在pcr反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个pcr过程,与常规pcr相比,具有特异性更强、敏感性更高、有效解决pcr污染、自动化程度高等特点。因其需要的取样量少、快速简便等优点,实时荧光pcr检测技术已广泛应用于病原体检测。



技术实现要素:

为了解决现有技术的缺陷及不足,本发明提供了一种牛双芽巴贝斯虫的taqman-bhqreal-timepcr特异性引物和探针及检测试剂盒与taqman-bhqreal-timepcr检测方法,建立一种简便、高效、实用的dna检测方法。该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测,应用前景广阔。

本发明采用的技术解决方案是:一种牛双芽巴贝斯虫的taqman-bhqreal-timepcr特异性引物和探针,包括设计的引物f、引物r和探针p,所述的引物f、引物r和探针p分别是按下述碱基序列由dna合成仪合成dna片段,具体为:

引物f:5′-tca-gcg-act-acg-tcc-att-tg-c-3′;

引物r:5′-aat-caa-ctt-ggc-agg-gtc-at-3′`;

探针p:5'-hex-ccg-cgt-aca-aga-ggt-gat-aca-gga-a-bhq-3′。

一种牛双芽巴贝斯虫的taqman-bhqreal-timepcr检测试剂盒,所述的taqman-bhqreal-timepcr检测试剂盒包括以下组分:

(一)real-timepcr预混液:主要成分为2×taqmanuniversalmastermix;

(二)权利要求1所述的引物f、引物r和探针p;

(三)阳性对照:所述的阳性对照为该对照为含有目的基因片段的重组质粒,该质粒含牛双芽巴贝斯虫798bp基因片段;

(四)阴性对照:所述的阴性对照为去离子水;

所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pucm-t转化dh5-α感受态细胞,经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。

一种采用所述的特异性引物和探针的牛双芽巴贝斯虫的taqman-bhqreal-timepcr检测方法,包括以下步骤:

(1)被检标本dna提取:取微小牛蜱数只,75%的酒精清洗,每只微小牛蜱放入单独的1.5mlepdof管,200μlpbs液浸没蜱,用样品破碎仪破碎蜱的虫体,吸取破碎后的溶液,加入trizol试剂裂解,采用常规的酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解,-20℃保存备用;

(2)以特异性引物和探针进行real-timepcr反应操作:将2×taqmanuniversalmastermix12.5μl,25pmol/μl的引物f1.0μl;25pmol/μl的引物r1.0μl;12.5pmol/μl的探针p1.0μl;dna模板2.0μl;ddh2o7.5μl,混匀后稍离心在25μl反应体系中进行荧光pcr反应操作;

(3)puc-18srrna质粒real-timepcr标准曲线制作:测定质粒d260nm值和d280nm值,用d260nm/d280nm值为1.8~2.0的质粒用于制作标准曲线;

(4)检测微小牛蜱传带的牛双芽巴贝斯虫18srrna基因:运行本发明中的反应参数,检出微小牛蜱dna中含有牛双芽巴贝斯虫18srrna基因,通过计算机利用分析软件得到real-timepcr扩增曲线,与阳性对照的扩增曲线比对,判断是否存在牛双芽巴贝斯虫18srrna基因。

所述的反应参数为ung酶消除残留污染处理为50℃,15mins;预变性处理为95℃,2mins;50个循环:变性处理95℃,10s,退火/延伸/收集荧光信号处理60℃,60s。

本发明的有益效果是:本发明提供了一种牛双芽巴贝斯虫的real-timepcr特异性引物和探针及检测试剂盒与taqman-bhqreal-timepcr检测方法,具体为一种牛双芽巴贝斯虫的taqman-bhqreal-timepcr特异性引物和探针及检测试剂盒与taqman-bhqreal-timepcr检测方法,以双芽巴贝斯虫的18srrna基因作为目标基因,该序列高度保守,pcr容易扩增,genbank数据库中相关序列信息丰富,根据taqman实时荧光pcr的基本原理,针对b.bigemina的18srrna为靶基因的特异性区域,结合其它巴贝斯虫18srrna基因的相关信息,设计2条特异性引物和1条探针,建立一种简便、高效、实用的dna检测方法,单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组dna即可作为模板进行鉴定,该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病快速检测,应用前景广阔,可以准确、快速的判断牛是否感染了牛双芽巴贝斯虫。

附图说明

图1为本发明方法对b.bigeminapuc-18srrna质粒进行real-timepcr敏感性检测的扩增曲线图;其中1为puc-18srrna质粒标准品浓度2x105拷贝/μl;2为puc-18srrna质粒标准品浓度2x104拷贝/μl;3为puc-18srrna质粒标准品浓度2x103拷贝/μl;4为puc-18srrna质粒标准品浓度2x102拷贝/μl;5为puc-18srrna质粒标准品浓度2x101拷贝/μl;6为puc-18srrna质粒标准品浓度2x100拷贝/μl;7为阴性对照。

图2为b.bigeminapuc-18srrna质粒常规pcr的敏感性检测凝胶电泳图;其中1为puc-18srrna质粒标准品浓度2x105拷贝/μl;2为puc-18srrna质粒标准品浓度2x104拷贝/μl;3为puc-18srrna质粒标准品浓度2x103拷贝/μl;4为puc-18srrna质粒标准品浓度2x102拷贝/μl;5为puc-18srrna质粒标准品浓度2x101拷贝/μl;6为puc-18srrna质粒标准品浓度2x100拷贝/μl;7为阴性对照。

图3为本发明方法对b.bigeminapuc-18srrna质粒进行real-timepcr扩增建立的标准曲线。

图4为本发明方法对微小牛蜱dna检测b.bigemina18srrna的real-timepcr扩增曲线;其中1为阳性对照;2,3为b.bigemina18srrna;4为阴性对照。

具体实施方式

本发明提供一种牛双芽巴贝斯虫的real-timepcr检测方法,通过以下技术方案实现:

设置real-timepcr检测试剂盒,该试剂盒包括:

(1)real-timepcr反应液:主要成分是2×taqmanuniversalmastermix

(2)引物和探针:应用primerexpress3.0.1软件设计b.bigemina18srrna(genbankaccessionnumbers,ay603402,x59604和x59605)特异性引物和探针,引物f、引物r和探针p分别是按下述碱基序列由dna合成仪合成的dna片段:

引物f:5′-tca-gcg-act-acg-tcc-att-tg-c-3′;

引物r:5′-aat-caa-ctt-ggc-agg-gtc-at-3′`;

探针p:5'-hex-ccg-cgt-aca-aga-ggt-gat-aca-gga-a-bhq-3′。

(3)阳性对照:该对照为含有目的基因片段的重组质粒,由本研究室构建。其方法是:将扩增产物克隆至pucm-t转化dh5-α感受态细胞,经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒,命名为puc-18srrna,该质粒含牛双芽巴贝斯虫798bp基因片段。

(4)阴性对照,该对照为去离子水(ddh2o);

操作程序:

(1)被检标本dna提取:取微小牛蜱数只,75%的酒精清洗,每只微小牛蜱放入单独的1.5mlepdof管,200μlpbs液浸没蜱,用样品破碎仪破碎蜱的虫体,吸取破碎后的溶液,加入trizol试剂裂解,采用常规的酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(tris-edtate)溶解,-20℃保存备用;

(2)25μlreal-timepcr反应体系:

混匀后稍离心。

(3)real-timepcr反应参数:

(4)puc-18srrna质粒real-timepcr标准曲线制作

测定质粒d260nm值和d280nm值,d260nm/d280nm值在1.8~2.0的质粒用于制作标准曲线。根据d260nm值计算质粒浓度,并换算成拷贝数(raymond等,2004),以去离子水10倍系列稀释成6个梯度(2x105-2x100拷贝/μl),以此为模板,建立25μlreal-timepcr反应体系,根据优化的反应参数,在荧光pcr仪上扩增。反应结束后,计算机利用分析软件得到标准曲线。本发明中,荧光pcr仪自带软件分析显示,扩增效率efficiency=94.16%、相关系数r2=0.999,表明ct值与标准品之间存在良好线性关系,y=-3.47x+39.378。

(5)puc-18srrna质粒real-timepcr敏感性检测

将puc-18srrna质粒标准品浓度分别为2x105、2x104、2x103、2x102、2x101、2x100拷贝/μl作为模版,分别进行常规pcr和real-timepcr,比较这2种检测方法的敏感性。结果显示,real-timepcr的最低检测浓度为2x100拷贝/μl;常规pcr的最低检测浓度为2x103拷贝/μl,表明real-timepcr的检测灵敏度比常规pcr高1000倍。

(6)检测微小牛蜱传带的牛双芽巴贝斯虫18srrna基因

使用本发明中组装的试剂盒,以微小牛蜱dna作为被检样品,以puc-18srrna质粒为阳性对照,ddh2o为阴性对照,运行本发明中的反应参数,通过计算机分析软件得到real-timepcr扩增曲线,与阳性对照的pcr扩增曲线比对,判断是否存在牛双芽巴贝斯虫18srrna基因。如图4所示。

相对于目前对于蜱虫体内传带牛双芽巴贝斯虫的鉴定方法,常规pcr和巢式pcr的检测方法也有诸多报道,但本发明建立了更为敏感的real-timepcr方法。单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组dna即可作为模板进行鉴定。

目前血涂片镜检技术仍是诊断牛双芽巴贝斯虫病最合适的方法,但该方法不能应用于外周血内寄生虫含量很低的动物以及感染耐过后带虫动物的检测。而采集牛体表寄生的蜱,通过提取蜱的dna,利用设计的牛双芽巴贝斯虫引物和探针扩增目的基因,可以准确、快速的判断牛是否感染了牛双芽巴贝斯虫。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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