本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2、制备方法及应用。
背景技术：
长牡蛎是一种重要的海水养殖贝类。由于长牡蛎缺乏适应性免疫防御系统，主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物的侵染，因此细菌、真菌和病毒引起的多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。包含dm9结构域的蛋白首先在果蝇中被发现。之后，magalhaes等在鱼类中发现了一些具有dm9结构域的毒素，并将其命名为“natterin”，此类毒素含有n-端的dm9结构域和c-端毒素/细菌毒素（etx/mtx2）结构域。natterin可以在人体组织中产生细胞毒性作用，从而导致细胞坏死、水肿、局部疼痛等现象。最新的研究表明，natterin具有穿孔素的功能。近几十年中，越来越多的含有dm9结构域的蛋白质（dm9cps）在包括节肢动物、扁形动物等无脊椎动物中被发现，并且证明dm9cps参与机体的免疫反应。例如，在冈比亚按蚊中，一种名为“引起疟原虫唾液腺反应”的dm9cps(prs1)，唾液腺侧叶上的表达量在疟原虫入侵后显著升高，并随感染孢子虫数量的增加而增加。
但是，迄今为止并没有关于长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2、制备方法及在制备抑制毕赤酵母菌药物中应用的相关报道。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2、制备方法及应用。
本发明的技术解决方案是：一种长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2，其特征在于：氨基酸序列如seqidno.1所示。
一种上述长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a.用特定引物p1和p2对长牡蛎cgdm9cp-2基因编码区片段进行pcr扩增，所述引物p1的dna序列如seqidno.2所示，所述引物p2的dna序列如seqidno.3所示；
b.将pcr扩增产物与pet-30a载体经nde1和xho1酶切后通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
c.将上述重组子转入大肠杆菌transetta（de3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表seqidno.1中氨基酸序列的重组蛋白。
一种上述长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2在制备抑制毕赤酵母菌药物中的应用。
本发明利用体外重组表达技术获得了长牡蛎含dm9结构域的蛋白cgdm9cp-2，该重组蛋白具有结合mannose、lps和pgn的生物学活性，同时在机体外对毕赤酵母菌具有较强的抑制作用。本发明的长牡蛎含dm9结构域的蛋白cgdm9cp-2作为一种有效的模式识别受体，在制备抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有应用价值。
附图说明
图1是本发明长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2与lps、pgn、mannose的结合活性示意图。
图2本发明长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2对毕赤酵母菌抑制效果示意图。
具体实施方式
本发明的长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2，氨基酸序列如seqidno.1所示。
上述长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2的制备方法，依次按照如下步骤进行：
1.重组载体的构建
用特定引物p1和p2对长牡蛎cgdm9cp-2基因编码区片段进行pcr扩增，所述引物p1的dna序列如seqidno.2所示，所述引物p2的dna序列如seqidno.3所示；
pcr反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pmd19-t载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用nde1和xho1两个酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经nde1和xho1两个酶酶切的表达载体pet-30a连接，完成载体的构建。
2.重组蛋白cgdm9cp-2的表达
将构建好的重组载体转化表达宿主菌transetta(de3)中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200ml的lb液体培养基中，220rpm，37℃培养至od600=0.4~0.8。加入iptg，使终浓度达到1mmoll-1，继续培养4小时。4℃，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl的5倍蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，sds-page检测表达产物。
3.重组蛋白cgdm9cp-2的纯化与复性
重组蛋白采用镍琼脂糖凝胶ff柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：
（1）镍琼脂糖凝胶ff装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；
（2）用缓冲液i（50mmoll-1tris-hcl缓冲液，ph=7.4,50mmoll-1nacl,8moll-1尿素）平衡2~5个床体积，流速为2mlmin-1；
（3）取经iptg诱导表达的细胞，用缓冲液i重悬，150w超声破碎30min，12000rmp，4℃离心30min，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mlmin-1；
（4）用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2mlmin-1；
（5）用有50mmoll-1咪唑的缓冲液i再洗2~5个柱床体积，流速为2mlmin-1；
（6）用400mmoll-1咪唑的缓冲液i洗脱目的蛋白，收集；
（7）用sds-page检测融合蛋白的表达；
（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mlmin-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mm的还原谷胱甘肽、0.4mm氧化谷胱甘肽、1mmedta、50mmtris-hcl、100mmnacl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6m逐渐替换到4m、3m、2m、1m、0m，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油，每次在4℃透析12h。即得到长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2，氨基酸序列如seqidno.1所示。
长度：143个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
特性：分子量为16kda，等电点为8.64，具有两个保守的dm9结构域。
实验例1：本发明的长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2与mannose、lps、pgn结合活性的检测
步骤如下：
1.将10μg各种pamps分别溶于50mm碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，每孔100μl包被酶标板，4℃，过夜。
2.pbs-t洗3次，每次5min，每孔加入200μl3%bsa，37℃封闭1h。
3.pbs-t洗3次，每次5min，每孔加入100μl2倍梯度稀释的本发明实施例长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2，18℃孵育3h。
4.pbs-t洗3次，每次5min，每孔加入100μl稀释的抗目的蛋白的多克隆抗体（1:1000），37℃孵育1h。
5.pbs-t洗3次，每次5min，每孔加入100μl碱性磷酸酶标记的羊抗大鼠igg（1:4000），37℃孵育1h。
6.pbs-t洗3次，每次5min，每孔加入100μl含有0.1%(w/v)p-nitrophenylphosphate（pnpp）和0.5mmmgcl2的50mm碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（ph9.8），避光发色10~30min，每孔加入50μl2mnaoh终止发色，酶标仪405nm处读取并记录数值。
实验中每个孔设3个重复，以重组trx蛋白作为蛋白对照，读数时以tbs缓冲液为空白。数据分析时，实验组（p）/阴性对照组（n）>2.1的孔视为阳性。结果如图1所示。结果表明本发明长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2具有结合mannose、lps和pgn的生物学活性。
实验例2：本发明的长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2抑菌活性检测
具体步骤如下：
1.微生物的培养及制备
毕赤酵母（实验室保存菌种）用ypd培养基28℃，220rpm，培养到对数生长期时，分别用tris-hcl（50mmoll-1,ph=8.0）稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×103cfu；
2.重组蛋白cgdm9cp-2抑菌活性测定
对数生长期的毕赤酵母离心收集后用tbs（50mmtris-hcl,150mmnacl）清洗重悬（104cfu）。50μl的本发明实施例长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2与等体积的毕赤酵母室温孵育2h。取20μl上述混合物于平底96孔板（costar，fisher）中，每孔分别加入200μlypd和2216e液体培养基，于酶标仪中28℃振荡培养，每隔1h分别检测记录各孔od600值。另设rtrx蛋白对照组。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图，研究数据采用spss6.0软件进行统计学分析，显著差异（p<0.05）用*标记。结果见图2。实验表明本发明的长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2能够抑制毕赤酵母的生长。
序列表
<110>大连海洋大学
<120>长牡蛎含dm9结构域蛋白cgdm9cp-2、制备方法及应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>143
<212>prt
<213>长牡蛎(crassostreagigas)
<400>1
metalaglutrplyslysthrserglyserlysileproaspasnala
151015
ileargalaglytyrglulysaspglylysproleupheilealaarg
202530
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130135140
<210>2
<211>34
<212>dna
<213>人工序列(crassostreagigas)
<400>2
<210>3
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(crassostreagigas)
<400>3