利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法。

背景技术：

丝状真菌里氏木霉(trichodermareesei)是工业上主要的纤维素酶半纤维素酶生产菌株，是美国fda认证的食品安全级菌株。里氏木霉具有强大的蛋白分泌能力，某些突变株的外分泌蛋白量可达100g/l，并具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，得到国际著名酶制剂公司(如genencor、novozymes等)的高度重视，并成功应用于多种药物、化学试剂以及酶制剂的表达和生产。近年来，随着里氏木霉基因组学的快速发展及其遗传操作系统的不断完善，利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白也越来越受到重视。

值得指出的是，里氏木霉中外源dna片段多以非同源末端连接的途径nhej(nonhomologousend-joining)整合入基因组，呈随机插入的形式。重组蛋白的基因表达框在基因组中的不同的插入位点会直接影响到其表达水平。例如，若重组基因插入到沉默子的调控区可能直接导致其不能转录而表达失败，如果外源基因插入到增强子的调控区域也可能使其表达量大幅度提高。里氏木霉中纤维二糖水解酶基因(cbh1)的位点通常被认为是基因高效表达的位点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法。

本发明所提供的利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法，可包括如下步骤：将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区。

其中，所述“将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区”可为如下任一：

(a)用所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒取代所述里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区的任意片段；

(b)将所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒插入到所述里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区的任意位置。

进一步地，所述里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区的核苷酸序列为seqidno.1。

在本发明的实施例中，所述“将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区”具体为：将所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒取代所述里氏木霉基因组中seqidno.1的第429-551位。

如同本领域的常规理解，在上述方法中，所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒自5’端到3’端依次包含启动子、由所述启动子启动表达的所述待表达的目的蛋白的编码基因，以及终止子。当然，根据需要还可以包含其他类型的调控序列。

术语“|表达盒”是包含目的基因及其表达所必需的所有调控序列的双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达目的基因。所述调控序列包括但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与目的基因的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导目的基因表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mrna非翻译区。前导序列可操作连接于目的基因的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。在这些例子中，应将目的基因的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于目的基因的适当位置，以使调控序列指导目的基因的表达。

在本发明的一个实施例中，所述启动子为来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶i基因的启动子；所述终止子为来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶i基因的终止子。

在本发明的另一个实施例中，所述启动子为来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶i基因的启动子；所述终止子为来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶ii基因的终止子。

进一步地，所述来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶i基因的启动子的序列具体为seqidno.2的第1-2078位或seqidno.3的第1939-4016位。所述来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶i基因的终止子的序列具体为seqidno.2的第3685-5927位。所述来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶ii基因的终止子的序列具体为seqidno.3的第5693-7784位。

在上述方法中，所述待表达的目的蛋白为来源于真核生物的蛋白或来源于原核生物的蛋白。

进一步地，所述真核生物可为真菌、植物或动物。

更进一步地，所述真菌在本发明中具体为黑曲霉或里氏木霉。

在本发明的一个实施例中，所述待表达的目的蛋白为来源于黑曲霉的脂肪酶，其氨基酸序列同seqidno.2的第2138-2947位编码所得的氨基酸序列。

在本发明的另一个实施例中，所述待表达的目的蛋白为来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶i，其氨基酸序列同seqidno.3的第4017-5692位编码所得的氨基酸序列。

在上述方法中，所述“将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区”可通过向里氏木霉宿主菌中导入重组表达载体来实现；所述重组表达载体上含有所述表达盒，以及位于所述表达盒上下游用于定点插入或替换的同源臂。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述同源臂具体为seqidno.3的第1-1938位(上游同源臂)和第7785-9710位(下游同源臂)所示的两段dna片段。

本发明通过对一系列异源脂肪酶基因随机插入到里氏木霉基因组不同位置的转化子进行流式细胞仪的高通量筛选，并对脂肪酶表达量较高的转化株进行基因拷贝数和插入位点的鉴定，最终对一株重组蛋白基因为单拷贝的高产菌株进行插入位点分析，鉴定出除了里氏木霉cbh1位点以外的另一个有利于基因表达的基因插入位点nd1。最后在cbh1基因缺失株中，将cbh1基因的表达骨架整合入该位点，并与野生菌株比较cbh1基因的表达水平，发现将重组基因插入该位点，可以获得与cbh1位点相当的表达水平。本发明进一步丰富完善了利用里氏木霉作为宿主高效表达重组蛋白的技术方案。

附图说明

图1为质粒psklr的结构示意图。

图2为原生质体的制备及红色荧光蛋白的诱导表达示意图。

图3为红色荧光蛋白和脂肪酶表达量的对应关系示意图。

图4为重组脂肪酶基因在菌株nd1中的表达水平检测结果图。

图5为构建菌株nd1cbh1所需要的组件片段。

图6为cbh1基因在菌株tu6、nd1和nd1cbh1菌株中的表达水平检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

里氏木霉(trichodermareesei)qm9414：atcc26921。

里氏木霉(trichodermareesei)tu6：atccmya-256，同时记载于“egruber,j.visserc.p.kubicek,l.h.degraaff.thedevelopmentofaheterologoustransformationsystemforthecellulolyticfungustrichodermareeseibasedonapyrg-negativemutantstrain.currgenet(1990)18:71-76”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

里氏木霉(trichodermareesei)n10：记载于“linaqin,fu-rongcai,xin-ruidong,zhen-banghuang,yongtao,jian-zhonghuang,zhi-yangdong.improvedproductionofheterologouslipaseintrichodermareeseibyrnaimediatedgenesilencingofanendogenichighlyexpressedgene.bioresourtechnol,2012,109:116-122.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

里氏木霉(trichodermareesei)tr1124：已于2012年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.6384。并记载于中国专利申请201210271826.2。

里氏木霉(trichodermareesei)tu6δku70：该菌株的构建见“genetargetinginanonhomologousendjoiningdeficienthypocreajecorina”一文，，该文献中，菌株命名为δtku70,但后来有文章发表，该菌株被命名为tu6δku70，见文章“anovelmajorfacilitatortransportertrstr1isessentialforpentoseutilizationandinvolvedinxylanaseinductionintrichodermareesei,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2015,460(3):663-669”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

质粒psk-lip记载于“linaqin,fu-rongcai,xin-ruidong,zhen-banghuang,yongtao,jian-zhonghuang,zhi-yangdong.improvedproductionofheterologouslipaseintrichodermareeseibyrnaimediatedgenesilencingofanendogenichighlyexpressedgene.bioresourtechnol,2012,109:116-122”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

质粒pdsred-monomer-n1：为takara公司产品，货号：632465。

质粒pbluescriptsk(+)：为snapgene,addgene产品。

实施例1、利于重组基因表达的里氏木霉基因组插入位点nd1的获得及应用实例

本发明利用来源于口蹄疫病毒footandmouthdiseasevirus(fmdv)中的一段多肽2a序列作为连接肽将红色荧光蛋白基因dsred与一个来源于黑曲霉的脂肪酶基因lipa在里氏木霉中进行融合表达。2a序列可以使dsred基因和lipa基因呈1：1的比例进行表达，lipa基因因引入信号肽序列将被分泌至细胞外，而红色荧光蛋白将作为报告基因留在细胞内作为标记基因用于流式细胞仪的高通量筛选。融合表达骨架随机整合入里氏木霉基因组，因插入位点和拷贝数的不同会产生重组蛋白表达量各不相同的转化子，通过流式细胞仪筛选获得一株重组蛋白表达量较高的转化子，对这株转化子的拷贝数进行鉴定发现该菌株中重组基因为单拷贝，随后对重组基因的插入位点进行了分析获取插入位点两端的侧翼序列，最后在cbh1基因缺失株中，将cbh1基因的表达骨架整合入该位点，并与野生菌株比较cbh1基因的表达水平，发现将重组基因插入该位点，可以获得与cbh1位点相当的表达水平。

一、利于重组基因表达的里氏木霉基因组插入位点nd1的获得

(一)重组质粒的构建

1、红色荧光蛋白与异源脂肪酶融合表达载体psklr的构建

(1)pcr扩增纤维二糖水解酶i(cbh1)基因的启动子和终止子

以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，pcbh1-f，pcbh1-r为引物进行pcr扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min，扩增得到cbh1基因的启动子片段pcbh1。同样，以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，tcbh1-f，tcbh1-r为引物进行pcr扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min，扩增得到cbh1基因的终止子片段tcbh1。琼脂糖凝胶电泳，分别对两片段进行胶回收。

(2)重叠延伸pcr扩增红色荧光蛋白，2a序列与脂肪酶基因的融合片段l2ar

第一轮pcr：以质粒psk-lip为模板，lipase2a-f，lipase2a-r为引物扩增含有2a序列和部分红色荧光蛋白基因片段的脂肪酶基因片段。以质粒pdsred-monomer-n1为模板，2ared-f，2ared-r为引物扩增含有2a序列和部分脂肪酶基因片段的红色荧光蛋白基因。将这两个片段进行琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒纯化。

第二轮pcr：将胶回收纯化的两个pcr产物等摩尔混合作为模板，lipase2a-f，2ared-r为引物进行overlappcr扩增即可得到两个基因融合的片段l2ar，将该片段克隆入pmd18t-simple载体中进行测序。

(3)融合表达载体psklr的构建

用限制性内切酶sali和noti对质粒pbluescriptsk(+)进行双酶切，用限制性内切酶sali和ecori对pcbh1片段进行双酶切消化，用限制性内切酶ecori和spei对l2ar进行双酶切消化，用限制性内切酶spei和noti对tcbh1进行双酶切消化，将消化好的载体片段、pcbh1片段、lar片段、tcbh1片段混合进行四片段连接，转化大肠杆菌top10，菌落pcr鉴定转化子克隆，所用引物为lipase2a-f和2ared-r，挑取鉴定正确的克隆抽提质粒，并经测序验证正确后即得融合表达载体psklr(结构见图1)。

2、尿嘧啶缺陷筛选标记载体pskpyr4的构建

(1)里氏木霉pyr4基因的克隆

以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，pyr4-f，pyr4-r为引物进行pcr扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。将所得pcr产物于1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，ta克隆连入pmd18t-simple载体中，进行测序。

(2)质粒载体pskpyr4的构建

分别用限制性内切酶clai和ecori对质粒pbluescriptsk(+)和测序正确的pyr4基因ta克隆质粒进行双酶切，回收酶切处理的pbluescriptsk(+)载体片段和pyr4基因片段，并进行连接。转化大肠杆菌top10，挑取转化子进行菌落pcr鉴定，所用引物为pyr4-f，pyr4-r，pcr条件同前，提取质粒并经测序验证正确后即得尿嘧啶缺陷菌株tu6的互补质粒载体pskpyr4。

上述构建重组质粒过程中所用到的全部引物均具体参见表1。

表1用于构建重组载体的引物

(二)融合表达红色荧光蛋白和异源脂肪酶的里氏木霉转化子的获得

1、里氏木霉菌株tu6的原生质体制备

(1)取新鲜培养的斜面或平板上的里氏木霉(trichodermareesei)tu6的孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种至装有100mlmm培养基(2％葡萄糖为碳源)的500ml三角瓶中，28℃培养13h-14h，至菌丝伸展。

(2)将培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最后用1.2m的mgso4溶液洗涤一次，让溶液自然流尽；

(3)将筛子上的菌体冲洗到装有15ml裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg的裂解酶lysingenzymesigma,cat.no.l-1412和15mg纤维素酶cellulaser-10,yakult,japan的1.2mmgso4)，30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次；

(4)当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6m的山梨醇溶液终止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min收集原生质体沉淀；

(5)沿着沉淀一侧倒去上清，原生质体沉淀用1.0m山梨醇溶液重悬，室温3000rpm离心10min；

(6)重复步骤(5)，弃上清将原生质体悬浮于200μl1.0m山梨醇溶液中，血球板计数器观察并计数。

2、融合表达载体的里氏木霉转化

(1)将质粒pskpyr4和psklr进行大量抽提并用2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3.0m醋酸钠(ph5.2)过夜沉淀，用70％乙醇洗涤2次，用灭菌ddh2o溶解，使各个质粒浓度达μg级。

(2)质粒pskpyr4与psklr按摩尔比1:3至1:10的比例混合，体积不超过20μl，将该混合液加入到上述制备的原生质体中，轻轻混匀，再往其中各加入50μlpeg4000，再次混匀，冰上放置30min；设对照，对照用等体积的无菌水代替dna混合液。

(3)再往上述管中各加入1mlpeg4000，混匀，室温放置20min。

(4)最后再各自加入1ml1.0m山梨醇，再次混匀，将所有的原生质体转化液转移至装有50ml诱导培养基的250ml三角瓶中，诱导培养基配方为每升培养基中含1g葡萄糖，1g甘油，20g乳糖，180g山梨醇，0.05g(nh4)2so4，0.15gkh2po4，0.006gmgso4，0.006gcacl2，0.00005gfeso4·7h2o，0.000016gmnso4·h2o，0.000014g，znso4·7h2o，0.00002gcocl2。培养条件为30℃，100rpm缓慢震荡培养24h后将转速调至200rpm继续震荡培养。

(5)30℃培养3-6天后，收集所有的菌丝，再次制备原生质体进行流式细胞仪分选用(见图2)。图2中，a：原生质体在再生诱导培养基中诱导96h后的菌丝生长状况；b：荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的诱导情况；c：普通光学显微镜下观察重新将诱导的转化子制备成的原生质体；d：荧光显微镜下观察重新将诱导的转化子制备成原生质体后红色荧光蛋白的表达情况。由图2可见，成功表达重组蛋白后，将菌丝制备成原生质体，红色荧光仍有明显表达，可用于流式细胞仪分选。

(三)转化子的流式细胞仪筛选

1、样品制备：收集所有转化子在诱导条件下再生的菌丝，再次制备成原生质体悬液，400目筛子过滤。镜检观察原生质体制备的完整性并用血球计数板进行计数。将原生质体悬液调整至浓度为10⁷/ml的悬液，500μl。荧光显微镜观察红色荧光蛋白表达情况。

2、流式细胞分选仪调试：用facsaria流式细胞仪(美国bdfacsaria)分选原生质体中带rfp的细胞。100μm喷嘴，557nm绿光激发，鞘液压力为20psi。选定100μm喷嘴，超声清洗1分钟。开机后，打开主液流断点窗口，点击主液流，调节液流振动幅度(ampl)，使液滴间隔值(gap值)稳定，将调试参数尽量设置到最佳，保持主液流的连续性和稳定性。主液流稳定后，打开侧液流窗口电压，点击testsort，调整参数，使液流分束清晰。安装四路分选装置，打开侧液流窗口电压，点击testsort，收起废液抽屉，调整侧液流窗的电压滚动条，使偏转的分选液流落入相应的收集管中。将主液流窗中实际调出的dmpl值添到默认窗口中。

3、四通道细胞分选：以出发菌株tu6的原生质体作为阴性对照建立分选门。分选门的确定基于以下几个原则：完整的原生质体具有较高的前向角(forwardscatter，fsc)和侧向角(sidescatter，ssc)比值，相对于阴性对照，rfp阳性细胞在绿光通道(585nm)有强烈的发射光。细胞直接分选至原生质体再生培养基中(mm+山梨醇)。

4、转化子原生质体的二次筛选：将以上分选到的荧光强度最强的一组原生质体进行再生，再次制备原生质体悬液，进行96孔微孔板单个细胞分选，微孔板中装入诱导再生培养基。

(四)红色荧光蛋白和异源脂肪酶表达量的对应关系测定

96孔微孔板单个细胞分选后，选取荧光强度各不同的46株菌在pda固体平板上产孢，pda固体培养基的配方为每升培养基中含土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g。将孢子制备成孢子悬液接种种子瓶，种子瓶培养基的配方为每升培养基中含20g葡萄糖，0.05g(nh4)2so4，0.15gkh2po4，0.006gmgso4，0.006gcacl2，0.00005gfeso4·7h2o，0.000016gmnso4·h2o，0.000014g，znso4·7h2o，0.00002gcocl2。培养条件为30℃，200rpm震荡培养48h后，四层纱布过滤菌体，分别称取1.8g菌体接种至发酵培养基中，发酵培养基配方为种子培养基的碳源更换为乳糖即可，30℃，200rpm震荡培养96h后，测定发酵液上清的脂肪酶酶活，并对菌丝体荧光强度进行测定。

1、红色荧光蛋白的荧光测定

称取等重的菌丝体置于24孔微孔板中，用多功能荧光读板仪读取各个转化子的荧光值，设定激发光波长为557nm，发射光波长为585nm，采用13×13多点扫描的方式进行扫描后取其平均值，然后将不表达荧光蛋白的菌株tu6的荧光值设为1，转化子取相对荧光值。

2、脂肪酶的活性测定

脂肪酶的活性测定参照国标gb/t23535，反应底物为橄榄油乳化液。脂肪酶活力单位(u)定义为：在试验条件下，每毫升酶液每分钟催化底物释放出1μmol的游离脂肪酸，定义为一个脂肪酶活力单位(u)。

红色荧光蛋白和异源脂肪酶表达量的对应关系见图3，由图可以看出，转化子的红色荧光蛋白的表达水平与体外脂肪酶的活性趋势基本吻合，结果表明，利用2a序列作为连接肽融合表达红色荧光蛋白和脂肪酶，可以使这两个蛋白等量表达并独立存在，具有信号肽的脂肪酶可以有效分泌到胞外，而缺乏信号肽的红色荧光蛋白留在胞内作为报告基因进行流式细胞仪高通量筛选脂肪酶高表达的菌株。

(五)重组蛋白高产菌株中重组基因的基因拷贝数鉴定

1、提取重组蛋白高产菌株和对照菌株n10的dna。

(1)取重组蛋白高产菌株和里氏木霉(trichodermareesei)对照菌株n10，将各菌株10⁸的孢子悬液接种于含2％葡萄糖的mm培养基中培养36h后，200目筛子过滤收集里氏木霉菌丝，在滤纸上压干，液氮研磨至粉末状。

(2)每克菌丝加入5mldna抽提缓冲液，振荡混匀后于37℃水浴1h，每隔10min取出振荡混匀一次。

(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，体积比)溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min。

(4)将上清转移到一新的离心管中，加入0.5-0.6倍体积的冰预冷的异丙醇并颠倒混匀，于-20℃放置30-60min，然后在4℃，12000rpm离心10min。

(5)沉淀用75％乙醇洗涤两次，溶于50-100μl含20μg/mlrna酶的100mmtris-hcl(ph8.0)中，-20℃保存备用。

2、实时荧光定量pcr鉴定红色荧光蛋白和脂肪酶融合基因的拷贝数

以单拷贝基因actin基因作为标准内参，分别用引物actin-f/actin-r，liprt-f/liprt-r(表1)对n10和各个高产转化株的基因组dna进行扩增。所有的pcr反应均在abiprism7000real-timedetectionsystem(abi)仪器上进行，试剂为powersybrgreenpcrmastermix(abi)。体系为25μl，采用的步骤为：50℃2min；95℃预变性10min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。由于菌株n10中脂肪酶基因的拷贝数为单拷贝(参见文章：linaqin,fu-rongcai,xin-ruidong,zhen-banghuang,yongtao,jian-zhonghuang,zhi-yangdong.improvedproductionofheterologouslipaseintrichodermareeseibyrnaimediatedgenesilencingofanendogenichighlyexpressedgene.bioresourtechnol,2012,109:116-122.)，因此，各转化株中重组基因的拷贝数用2^-δδct法相对定量。

(六)重组基因单拷贝的重组蛋白高产菌株中插入位点的鉴定

在所有转化株中，质粒pskpyr4和psklr以随机插入的方式整合入里氏木霉基因组中，这个质粒除了含有红色荧光蛋白和脂肪酶融合蛋白完整的表达框以外，还具有针对大肠杆菌的复制子序列和氨苄抗性基因。因此我们采用质粒拯救的方法对基因的插入位点进行鉴定。本发明中主要针对一株重组蛋白基因为单拷贝的高产菌株nd1进行插入位点分析，具体操作过程如下：

1、用限制性内切酶sali消化5-10μg的基因组dna，待酶切完全后，65℃水浴10min，使限制性内切酶失活。

2、在酶切体系中加入1/10体积的3m醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀至少1h以上。

3、13000rpm，4℃离心15min，沉淀用70％的乙醇洗两遍，自然晾干或真空抽干，用50-100μl的无菌ddh2o溶解。

4、在下列连接体系中，16℃连接过夜。

5、65℃处理10min以失活t4dna连接酶。

6、加入1/10体积的3m醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀至少1h以上。

7、13000rpm，4℃离心15min，沉淀用70％的乙醇洗两遍，自然晾干或真空抽干，用5μl无菌ddh2o溶解dna。

8、将5μl无菌ddh2o溶解的dna全部转化大肠杆菌xl10-gold感受态细胞。

9、挑取大肠杆菌转化平板上的克隆，利用引物lip-f，lip-r(表1)进行菌落pcr鉴定，以确保所得克隆中含有脂肪酶基因。

10、提取以上步骤9中阳性克隆中的质粒并送测序公司进行测序，从而获得重组基因在基因组中整合位点的侧翼序列。

经过上述各步骤的筛选鉴定，最终获得菌株nd1。

第一，对菌株nd1进行重组脂肪酶基因的表达水平检测，结果如图4所示。图4中，a为sds-page检测纤维素条件下发酵120小时后的发酵液上清；b为纤维素条件下发酵120小时后的脂肪酶活性。里氏木霉菌株tr1124是一株将红色荧光蛋白基因和脂肪酶基因的融合基因整合入cbh1位点的脂肪酶高产菌株。图4的结果表明，通过流式细胞仪高通量筛选得到的菌株nd1也是一株脂肪酶高产菌株，而且在该菌株中脂肪酶基因没有整合入cbh1位点(详见下文)。

第二，由表2的结果可见，重组脂肪酶基因在nd1菌株中的拷贝数为单拷贝。

表2realtimepcr鉴定重组脂肪酶基因在nd1菌株中的拷贝数

第三，菌株nd1中重组基因插入位点分析

经检测菌株nd1中重组基因插入位点(将该插入位点记作nd1位点)位于proteinid为68606的基因和proteinid为68608的基因之间的非编码区(seqidno.1)。

测序结果显示：菌株nd1中重组基因lipa-red具体是取代了里氏木霉基因组中seqidno.1的第429-551位。

二、插入位点nd1对重组蛋白表达影响的分析

纤维二糖水解酶基因cbh1在基因组中的位置通常被认为是里氏木霉基因组中有利于基因表达的位点。为了比较步骤一所鉴定出的nd1位点与cbh1位点哪一个更有利于基因的表达。以同源重组率极高的里氏木霉菌株tu6δku70为出发株，将脂肪酶基因lipa整合入cbh1位点替换cbh1基因，同时将cbh1基因整合入步骤一所鉴定出的插入位点nd1，检测该菌株中cbh1基因的表达水平并与对照菌株tu6以及nd1进行比较。具体操作步骤如下：

1、构建如图5所示的组件片段

(1)以质粒psklr为模板，pcbh1-f，tcbh1-r(表1)为引物进行pcr扩增，扩增得到的片段即为图5中a所示片段。

图5中a所示片段的核苷酸序列如seqidno.2所示，其中第1-2078位为pcbh1启动子序列，第2138-2947位为lipase基因序列，第2948-2998位为2a序列，第2999-3676位为dsred序列，第3685-5927位为tcbh1终止子序列。

(2)以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，引物flup-f，flup-r(表1)为引物进行pcr扩增，扩增得到的片段为插入位点上游同源臂序列；以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，pcbh1-2f，cbh1-2r(表1)为引物进行pcr扩增，扩增得到的片段为cbh1基因的启动子及orf序列；以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，引物tcbh2-f和tcbh2-r(表1)为引物进行pcr扩增，所得片段为cbh2基因终止子序列；以里氏木霉(trichodermareesei)qm9414基因组dna为模板，引物fldown-f，fldown-r(表1)为引物进行pcr扩增，扩增得到的片段为插入位点下游同源臂序列；以质粒pbluescriptsk(+)为模板，引物vec-f，vec-r(表1)进行pcr扩增，扩增得到的片段为载体骨架片段。将pcr扩增得到的这些片段进行胶回收，利用gibson克隆试剂盒进行连接，并转化大肠杆菌xl10-gold感受态细胞，构建载体pnd1-cbh1。以质粒pnd1-cbh1为模板，引物flup-f，fldown-r(表1)为引物进行扩增，扩增得到的片段即为图5中b所示的组件片段。

图5中b所示片段的核苷酸序列如seqidno.3所示，其中第1-1938位为上游同源臂序列，第1939-4016位为pcbh1启动子序列，第4017-5692位为cbh1基因序列，第5693-7784位为tcbh1终止子序列，第7785-9710位为下游同源臂序列。

2、将以上pcr扩增得到的组件片段(即seqidno.2和seqidno.3所示的两个片段)进行pcr纯化后，与质粒psk-pyr4共同转化里氏木霉菌株tu6δku70，转化方法如步骤一(二)。

3、pcr鉴定阳性转化子：获得转化子后，提取dna，引物对ocbh1-f/lip-r(表1)进行pcr，以此鉴定脂肪酶基因是否整合入cbh1位点，引物对ond1-f/vcbh1-r(表1)进行pcr鉴定cbh1基因是否整合入nd1位点。经鉴定的阳性转化子命名为nd1cbh1。

菌株nd1cbh1中cbh1表达盒取代了里氏木霉基因组中seqidno.1的第429-551位。

4、以上阳性转化株中cbh1基因表达量的分析：将阳性转化子nd1cbh1以及对照菌株tu6和nd1接种于pda平板上产孢，用无菌水将孢子洗下来制备成孢子悬液，200目筛子过滤，孢子悬液的浓度调整至10⁸/ml，在装有50mlmm培养基(2％葡萄糖为碳源)的250ml三角瓶中接种1ml孢子悬液，28℃，200rpm培养48h后，四层纱布过滤菌体，称取1.8g湿菌体转接至250ml三角瓶的50mlmm+1％微晶纤维素的培养基中。其中接种菌株tu6的培养基中需添加5mm的尿苷，纤维素诱导培养基中培养120h后，sds-page电泳检测它们的发酵液上清中cbh1分泌情况，并测cbh1的酶活。并提取菌体dna和rna，实时荧光定量pcr分析cbh1基因的拷贝数及其mrna水平。

(1)cbh1基因在菌株nd1cbh1中拷贝数的鉴定。收集菌株tu6和nd1cbh1的菌丝，液氮中研磨并提取总dna，以单拷贝基因actin基因作为标准内参，分别用引物actin-f/actin-r，rtcbh1-f/rtcbh1-r(表1)对菌株tu6和nd1cbh1的基因组dna进行扩增。所有的pcr反应均在abiprism7000real-timedetectionsystem(abi)仪器上进行，试剂为powersybrgreenpcrmastermix(abi)。体系为25μl，采用的步骤为：50℃2min；95℃预变性10min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。由于菌株tu6中cbh1基因的拷贝数为单拷贝(参见文章genomesequencingandanalysisofthebiomass-degradingfungustrichodermareesei(syn.hypocreajecorina)中的表3)，因此，nd1cbh1菌株中基因的拷贝数用2^-δδct法进行相对定量。

(2)realtimepcr分析cbh1基因的mrna水平。收集菌丝，液氮中研磨并提取总rna，采用两步法进行实时荧光定量pcr实验。

第一步：反转录

将以下试剂加入到200μlpcr管中：

65℃孵育10min；立即取出放于冰上5min；

加入下列试剂：

将反应混合物于50℃孵育1h；再升温至85℃10min以灭活反转录酶。

第二步：realtimepcr

所有的pcr反应均在abiprism7000real-timedetectionsystem(abi)仪器上进行，试剂为powersybrgreenpcrmastermix(abi)。反应参照abiprism7000使用说明，体系为25μl，采用的步骤为：50℃2min；95℃预变性10min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。基因的转录水平均以actin基因作为内参。

(3)纤维二塘水解酶(cbh)的酶活测定

用4-methylumbelliferyl-d-cellobioside(muc,sigma)作底物，称取15mgmuc，溶于500μldmso(sigma)，再将其转移到30ml柠檬酸缓冲液(ph4.850mm)中。将12μl适当稀释的酶液和200μlmuc、25μl葡萄糖(1m)和25μl柠檬酸缓冲液混合，此为不加纤维二糖实验组。在混合溶液中，葡萄糖会抑制bg(β-glucosidase,β-葡萄糖苷酶)降解muc，因此，测得的活性实际为cbh1和eg(endoglucosidase内切葡聚糖酶)的活性。同时设置加纤维二糖实验组：12μl酶液和200μlmuc、25μl葡萄糖、25μl(50mm)纤维二糖和25μl柠檬酸缓冲液，于50℃反应10min。加入纤维二糖会抑制cbh的活性，因此测得的是eg的活性。加入250μlna2co3(1m)。取100μl稀释11倍，于370nm测定吸光度。将不加纤维二糖实验组od值减去加纤维二糖实验组，即为cbh较为特异的活性。一单位的cbh酶活定义为每秒催化1nmolmuc水解所需要的酶量。

5、结果

cbh1基因在菌株nd1cbh1中拷贝数的鉴定结果如表3所示，可见：cbh1基因在菌株nd1cbh1中的拷贝数与菌株tu6接近，为单拷贝。

表3realtimepcr鉴定重组cbh1基因在nd1cbh1菌株中的拷贝数

cbh1基因在菌株tu6、nd1和nd1cbh1菌株中的表达水平鉴定结果如图6所示。图6中，a为sds-page检测纤维素条件下发酵120小时后的发酵液上清；b为纤维素条件下发酵120小时后的cbh活性。由图可见：cbh1基因在nd1位点的表达水平与菌株tu6相当，说明该位点对重组基因表达水平的贡献与cbh1基因相当。

<110>福建师范大学

<120>利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法

<130>gncln172245

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

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