一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种不依赖于高能量分子的恒温扩增技术，特别涉及一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒。
背景技术：
：淋球菌（n.gonorrhoeae）为严格的人体寄生菌，常存在于急性尿道炎与阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，形态染色类似于脑膜炎球菌。引发淋病的病原体是“淋病奈瑟氏菌”，即俗称的淋球菌。这种病菌拥有自我调节能力，能够通过变异获得抗药性，或者至少使药物的疗效下降，并且它正在对越来越多种类的抗生素发展出这种免疫力，先是青霉素对它失效，再是四环素，环丙沙星，而现在到了头孢克肟。1879年，奈瑟从35例急性尿道炎、阴道炎及新生儿急性结膜炎病人的分泌物中，分离出淋病双球菌。1885年，bumm在人、牛或羊的凝固血清培养基上培养淋球菌获得成功，将菌种接种于健康人的尿道内也可产生同样的症状。至此，淋球菌是淋病的病原体的结论始告成立。淋球菌培养要求高，一般不易培养，需在培养基中加入腹水或血液。它是嗜二氧化碳的需氧菌，在ph6.5-7.5，温度35-37℃，含5%-10%二氧化碳环境中生长迅速。抵抗力弱，不耐干燥和寒冷，42℃存活20分钟，50℃仅存活5分钟，100℃立即全部死亡，对一般消毒剂敏感，对磺胺、青霉素较敏感，但易产生耐药性。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基，均含有抗生素，可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃，70%湿度，含5%-10%co2（烛缸）环境中培养，24-48小时观察结果。培养后还需进行菌落形态，革兰氏染色，氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。人类是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性接触而传播。淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖，男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫颈炎。如治疗不彻底，可扩散至生殖系统。胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结膜炎。人类对淋球菌无自然免疫力，均易感，病后免疫力不强，不能防止再感染。检测淋球菌对于妇产科疾病以及不孕不育的预防和诊断有着较为重大的意义。基于病原体dna直接进行检测，相比培养法，悬滴法镜检等传统方法大大提高灵敏度，可以极大提升阳性检出率。目前检测淋球菌的恒温扩增技术，虽检测快速但检测灵敏度不高，试剂使用时需要严格的低温配制环境，且易出现错配。技术实现要素：针对现行技术检测灵敏度不高，试剂使用时需要严格的低温配制环境，且易出现错配等问题，本发明提供了一种灵敏度高，试剂使用时更方便，降低错配几率的检测淋球菌试剂盒。本发明所采取的技术方案是：一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒，包括反应液、启动液、反应酶系、特异性引物探针，所述反应液含有四甲基氯化铵，启动液含有乙酸镁，反应酶系含有修饰聚合酶。进一步的，所述反应液包括：tris-hcl20-70mmkcl30-90mm四甲基氯化铵100-300μm二硫苏糖醇1-4mm甜菜碱0.1-2m海藻糖3-8%peg3-8%bsa0.05-0.2mg/ml。更进一步的，tris-hcl的ph为7.0～9.0，优选ph为8.3。进一步的，所述启动液包括：乙酸镁5mm~20mm。更进一步的，所述乙酸镁浓度为10mm。进一步的，所述反应酶系包括：dntps100-300um修饰聚合酶20-100u单链结合蛋白200-300ng/ul重组酶300-400ng/ul上游引物100-300nm下游引物100-300nm荧光探针50-70nm。更进一步的，重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。进一步的，所述上游引物、下游引物及荧光探针序列为：检测淋球菌的上游引物序列：ccagagcttggcggtacataccacagaaa；下游引物的序列为：ttgctgcgtgattgctctctaattccgctaa；荧光探针序列为：attccttctcggtcgctttgcgattgcgctccaagt。进一步的，所述重组酶选自e.colirect蛋白、λ噬菌体β蛋白、啤酒酵母sepι/stpβ、啤酒酵母dpa蛋白、啤酒酵母stpα蛋白、粟酒裂殖酵母p140/exoǁ蛋白或rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白中的一种或多种。更进一步的，所述重组酶选自e.colirect蛋白。进一步的，所述聚合酶为经基因工程修饰的在35℃下低活性的修饰聚合酶，浓度为20-100u，优选50u。进一步的，恒温扩增的温度为35～42℃。更进一步的，优选扩增温度为37℃。本发明的有益效果：本发明的恒温扩增体系，不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大多数荧光定量扩增仪。本发明检测淋球菌。对比常规检测的培养方法和镜检方法，时间更短，灵敏度高受培养条件限制少，人为误操作几率低。本发明的恒温扩增体系与常规恒温扩增体系相比，镁离子使用乙酸镁，增加聚合酶活性。添加四甲基氯化铵，使引物与模板结合更紧密，大大增加实际灵敏度。本发明的恒温扩增体系与常规恒温扩增体系相比，使用修饰聚合酶，使试剂使用时不需要严格的低温配制环境。附图说明图1至图7依次分别为实施例1至实施例7的荧光结果图，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。说明书附图中的荧光值曲线偶有出现交叉或重合的情况，因此图中的标号难以清晰地标记到每一条荧光值曲线上，但是这并不影响本领域技术人员对本
发明内容的理解与实施。具体实施方式一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒，采用了一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括反应液，启动液，反应酶系，淋球菌特异性引物及探针，各成分的具体组分如下：一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒反应液的具体组分如下：tris-hcl（ph8.3）50mmkcl60mm四甲基氯化铵200μm二硫苏糖醇2mm甜菜碱1m海藻糖5.5%peg5.5%bsa0.1mg/ml一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒启动液的具体组分如下：品名摩尔浓度乙酸镁10mm一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）dntps200um修饰聚合酶bsu100ng/ul单链结合蛋白262ng/ul重组酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒特异性引物及探针序列如下：上游引物ccagagcttggcggtacataccacagaaa下游引物ttgctgcgtgattgctctctaattccgctaa荧光探针attccttctcggtcgctttgcgattgcgctccaagt下面结合具体的实验，进一步说明一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒的优势，但并非限制本发明。实验样本来源：以细菌性阴道炎患者中分离的淋球菌经提取得到的核酸溶液作为样本；以外购金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、阴道加德纳菌、白色念珠菌经提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；以正常人阴道分泌物提取物为阴性对照样本。实施例1（淋球菌的检测）：取2个200ul反应管，分别标记为反应管1~2。在反应管1~2中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系；在反应管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1中加入淋球菌样本2ul，反应管2加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。实施例2（非最优扩增温度条件的检测）：同实施例1，不同之处在于上机条件改为：35℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。实施例3（非最优扩增温度条件的检测）：同实施例1，不同处在于上机条件改为：42℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。实施例4（特异性实验）：按照实施例1配制体系8管，分别标记1~8反应管。在1~8反应管的体系中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）；在1~8号反应管中按顺序分别加入淋球菌、黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、阴道加德纳菌、白色念珠菌样本2ul；各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图4。实施例5（淋球菌重复性实验）：按实施例1配制体系10管，分别标记反应管1~10。在反应管1~10中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1~5中均加淋球菌样本2ul，在反应管6~10中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图5。实施例6（淋球菌灵敏度实验）按实施例1配制体系8管，分别标记反应管1~8。在反应管1~10中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1~7中加入不同浓度的淋球菌样本2ul，在反应管8中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图6。实施例7（是否有四甲基氯化铵对比）取2个200ul反应管，分别标记为反应管1~2。在反应管1~2中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系，其中反应管2中的反应液不添加四甲基氯化铵；在反应管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1、2中加入淋球菌样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图7。结论：1.从图1的结果可以看出，阴道加德纳氏菌反应管有“s”型扩增曲线，阴道对照管没有扩增曲线，说明本发明试剂盒的阴阳性恒温扩增效果好。2.从图2、3的结果可以看出，即使不是在最适温度下进行扩增反应，仍然得到稳定的阳性结果，说明本发明试剂盒有较宽的反应温度范围，非最优扩增温度下的样本出峰时间和信号值影响不大，试剂的容错率高、稳定性强，可以适用于温度不能精确控制的仪器或反应装置，使试剂盒的使用范围更为广泛。3.从图4的结果可以看出，非本试剂盒检测范围内的其他阴道内微生物（黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、阴道加德纳菌、白色念珠）没有曲线增长，检测结果阴性，而阳性对照（阴道加德纳）扩增结果阳性，说明试剂盒特异性较强。4.从图5的结果可以看出，淋球菌进行了重复实验，均得到相应的“s”型扩增曲线，扩增曲线出峰时间相差不超过1min，荧光信号波动范围小，说明本试剂盒的重复性好。5.从图6的结果可以看出，淋球菌进行了灵敏度实验，均得到相应的“s”型扩增曲线，样本浓度从1×105~1×102cfu/ml，在1×102cfu/ml下均为阳性，即使样本在极浓度下本试剂盒仍能稳定检测出阳性，说明本试剂盒的灵敏度高，适应临床上各种发病期的样本。6.从图7可以看出，当反应液中添加四甲基氯化铵，更早的时间出现“s”型扩增曲线，说明本发明中添加四甲基氯化铵比不添加，灵敏度更高。综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，容错率高，稳定性强，灵敏度高。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>广州和实生物技术有限公司<120>一种即时检测淋球菌的荧光恒温检测试剂盒<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>淋球菌(n.gonorrhoeae)<400>1ccagagcttggcggtacataccacagaaa29<210>2<211>31<212>dna<213>淋球菌(n.gonorrhoeae)<400>2ttgctgcgtgattgctctctaattccgctaa31<210>3<211>36<212>dna<213>淋球菌(n.gonorrhoeae)<400>3attccttctcggtcgctttgcgattgcgctccaagt36当前第1页12