用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用的制作方法

文档序号:18145672发布日期:2019-07-10 11:47

技术特征:

1.引物组合,由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成;

所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成;

所述引物Ⅰ-F3为如下(a1)或(a2):

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子;

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-B3为如下(a3)或(a4):

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-FIP为如下(a5)或(a6):

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子;

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-BIP为如下(a7)或(a8):

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子;

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LF为如下(a9)或(a10):

(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子;

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LB为如下(a11)或(a12):

(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子;

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成;

所述引物Ⅱ-F3为如下(b1)或(b2):

(b1)序列表的序列7所示的单链DNA分子;

(b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-B3为如下(b3)或(b4):

(b3)序列表的序列8所示的单链DNA分子;

(b4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-FIP为如下(b5)或(b6):

(b5)序列表的序列9所示的单链DNA分子;

(b6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-BIP为如下(b7)或(b8):

(b7)序列表的序列10所示的单链DNA分子;

(b8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LF为如下(b9)或(b 10):

(b9)序列表的序列11所示的单链DNA分子;

(b10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LB为如下(b11)或(b12):

(b11)序列表的序列12所示的单链DNA分子;

(b12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成;

所述引物Ⅲ-F3为如下(c1)或(c2):

(c1)序列表的序列13所示的单链DNA分子;

(c2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-B3为如下(c3)或(c4):

(c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子;

(c4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-FIP为如下(c5)或(c6):

(c5)序列表的序列15所示的单链DNA分子;

(c6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-BIP为如下(c7)或(c8):

(c7)序列表的序列16所示的单链DNA分子;

(c8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LF为如下(c9)或(c10):

(c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子;

(c10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LB为如下(c11)或(c12):

(c11)序列表的序列18所示的单链DNA分子;

(c12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成;

所述引物Ⅳ-F3为如下(d1)或(d2):

(d1)序列表的序列19所示的单链DNA分子;

(d2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-B3为如下(d3)或(d4):

(d3)序列表的序列20所示的单链DNA分子;

(d4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-FIP为如下(d5)或(d6);

(d5)序列表的序列21所示的单链DNA分子;

(d6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-BIP为如下(d7)或(d8):

(d7)序列表的序列22所示的单链DNA分子;

(d8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LF为如下(d9)或(d10):

(d9)序列表的序列23所示的单链DNA分子;

(d10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LB为如下(d11)或(d12):

(d11)序列表的序列24所示的单链DNA分子;

(d12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成;

所述引物Ⅴ-F3为如下(e1)或(e2):

(e1)序列表的序列25所示的单链DNA分子;

(e2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-B3为如下(e3)或(e4):

(e3)序列表的序列26所示的单链DNA分子;

(e4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-FIP为如下(e5)或(e6):

(e5)序列表的序列27所示的单链DNA分子;

(e6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-BIP为如下(e7)或(e8):

(e7)序列表的序列28所示的单链DNA分子;

(e8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LF为如下(e9)或(e10):

(e9)序列表的序列29所示的单链DNA分子;

(e10)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LB为如下(e11)或(e12):

(e11)序列表的序列30所示的单链DNA分子;

(e12)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子;

所述引物组Ⅵ由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB组成;

所述引物Ⅵ-F3为如下(f1)或(f2):

(f1)序列表的序列31所示的单链DNA分子;

(f2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-B3为如下(f3)或(f4):

(f3)序列表的序列32所示的单链DNA分子;

(f4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-FIP为如下(f5)或(f6):

(f5)序列表的序列33所示的单链DNA分子;

(f6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-BIP为如下(f7)或(f8):

(f7)序列表的序列34所示的单链DNA分子;

(f8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LF为如下(f9)或(f10):

(f9)序列表的序列35所示的单链DNA分子;

(f10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LB为如下(f11)或(f12):

(f11)序列表的序列36所示的单链DNA分子;

(f12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子。

2.权利要求1所述引物组合的应用,为如下(g1)-(g6)中的任意一种:

(g1)鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(g2)制备用于鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的试剂盒;

(g3)鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(g4)制备用于鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的试剂盒;

(g5)检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus;

(g6)制备用于检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的试剂盒。

3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)或(h3):

(h1)鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(h2)鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(h3)检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus。

4.权利要求3所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。

5.鉴别烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的方法,为方法A或方法B;

所述方法A包括如下步骤:以待测曲霉的基因组DNA为模板,分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ进行环介导等温扩增,如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为烟曲霉;如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为土曲霉;如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为构巢曲霉;如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为黄曲霉;如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为黑曲霉;如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测曲霉为或候选为Aspergillus calidoustus;

所述方法B包括如下步骤:检测待测曲霉基因组DNA中是否含有权利要求1所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ的靶序列,如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅰ的靶序列,待测曲霉为或候选为烟曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅱ的靶序列,待测曲霉为或候选为土曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅲ的靶序列,待测曲霉为或候选为构巢曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅳ的靶序列,待测曲霉为或候选为黄曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅴ的靶序列,待测曲霉为或候选为黑曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅵ的靶序列,待测曲霉为或候选为Aspergillus calidoustus。

6.鉴定待测微生物是否为烟曲霉或土曲霉或构巢曲霉或黄曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的方法,为方法C或方法D;

所述方法C包括如下步骤:以待测微生物的基因组DNA为模板,分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ进行环介导等温扩增,如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为烟曲霉;如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为土曲霉;如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为构巢曲霉;如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为黄曲霉;如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为黑曲霉;如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为或候选为Aspergillus calidoustus,如果采用引物对Ⅰ至引物组Ⅵ均不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增,待测微生物为非烟曲霉且非土曲霉且非构巢曲霉且非黄曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus;

所述方法D包括如下步骤:检测待测微生物基因组DNA中是否含有权利要求1所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ的靶序列,如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅰ的靶序列,待测微生物为或候选为烟曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅱ的靶序列,待测微生物为或候选为土曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅲ的靶序列,待测微生物为或候选为构巢曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅳ的靶序列,待测微生物为或候选为黄曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅴ的靶序列,待测微生物为或候选为黑曲霉;如果所述基因组DNA中含有所述引物组Ⅵ的靶序列,待测微生物为或候选为Aspergillus calidoustus;如果所述基因组DNA中不含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ中任一引物组的靶序列,待测微生物为非烟曲霉且非土曲霉且非构巢曲霉且非黄曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus。

7.检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的方法,为方法E或方法F;

所述方法E包括如下步骤:以待测样本的总DNA为模板,分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ进行环介导等温扩增,如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有烟曲霉;如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有土曲霉;如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有构巢曲霉;如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有黄曲霉;如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有黑曲霉;如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中含有Aspergillus calidoustus;如果采用引物对Ⅰ至引物组Ⅵ均不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增,待测样本中不含有烟曲霉且不含有土曲霉且不含有构巢曲霉且不含有黄曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus;

所述方法F包括如下步骤:检测待测样本总DNA中是否含有权利要求1所述引物组合中的引物组Ⅰ至引物组Ⅵ的靶序列,如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅰ的靶序列,待测样本中含有烟曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅱ的靶序列,待测样本中含有土曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅲ的靶序列,待测样本中含有构巢曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅳ的靶序列,待测样本中含有黄曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅴ的靶序列,待测样本中含有黑曲霉;如果所述总DNA中含有所述引物组Ⅵ的靶序列,待测样本中含有Aspergillus calidoustus;如果所述总DNA中不含有所述引物组Ⅰ至引物组Ⅵ中任一引物组的靶序列,待测样本中不含有烟曲霉且不含有土曲霉且不含有构巢曲霉且不含有黄曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus。

8.权利要求1中所述的引物组Ⅰ或引物组Ⅱ或引物组Ⅲ或引物组Ⅳ或引物组Ⅴ或引物组Ⅵ。

9.权利要求1中所述的引物组Ⅰ在制备试剂盒A中的应用,或,所述引物组Ⅱ在制备试剂盒B中的应用,或,所述引物组Ⅲ在制备试剂盒C中的应用,或,所述引物组Ⅳ在制备试剂盒D中的应用,或,所述引物组Ⅴ在制备试剂盒E中的应用,或,所述引物组Ⅵ在制备试剂盒F中的应用;

所述试剂盒A的用途为如下(i1)或(i2):

(i1)鉴定待测微生物是否为烟曲霉;

(i2)检测待测样本中是否含有烟曲霉;

所述试剂盒B的用途为如下(i3)或(i4):

(i3)鉴定待测微生物是否为土曲霉;

(i4)检测待测样本中是否含有土曲霉;

所述试剂盒C的用途为如下(i5)或(i6):

(i5)鉴定待测微生物是否为构巢曲霉;

(i6)检测待测样本中是否含有构巢曲霉;

所述试剂盒D的用途为如下(i7)或(i8):

(i7)鉴定待测微生物是否为黄曲霉;

(i8)检测待测样本中是否含有黄曲霉;

所述试剂盒E的用途为如下(i9)或(i10):

(i9)鉴定待测微生物是否为黑曲霉;

(i10)检测待测样本中是否含有黑曲霉;

所述试剂盒F的用途为如下(i11)或(i12):

(i11)鉴定待测微生物是否为Aspergillus calidoustus;

(i12)检测待测样本中是否含有Aspergillus calidoustus。

10.含有权利要求1中所述的引物组Ⅰ的试剂盒A,或,含有所述引物组Ⅱ的试剂盒B,或,含有所述引物组Ⅲ的试剂盒C,或,含有所述引物组Ⅳ的试剂盒D,或,含有所述引物组Ⅴ的试剂盒E,或,含有所述引物组Ⅵ的试剂盒F;

所述试剂盒A的用途为如下(i1)或(i2):

(i1)鉴定待测微生物是否为烟曲霉;

(i2)检测待测样本中是否含有烟曲霉;

所述试剂盒B的用途为如下(i3)或(i4):

(i3)鉴定待测微生物是否为土曲霉;

(i4)检测待测样本中是否含有土曲霉;

所述试剂盒C的用途为如下(i5)或(i6):

(i5)鉴定待测微生物是否为构巢曲霉;

(i6)检测待测样本中是否含有构巢曲霉;

所述试剂盒D的用途为如下(i7)或(i8):

(i7)鉴定待测微生物是否为黄曲霉;

(i8)检测待测样本中是否含有黄曲霉;

所述试剂盒E的用途为如下(i9)或(i10):

(i9)鉴定待测微生物是否为黑曲霉;

(i10)检测待测样本中是否含有黑曲霉;

所述试剂盒F的用途为如下(i11)或(i12):

(i11)鉴定待测微生物是否为Aspergillus calidoustus;

(i12)检测待测样本中是否含有Aspergillus calidoustus。

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