用于检测耶式肺孢子菌的LAMP引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测耶式肺孢子菌的lamp引物组合及其应用。

背景技术：

侵袭性真菌病(invasivefungaldisease，ifd)又称侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection，ifi)、深部真菌感染(deepfungalinfection,dfi)，是指真菌侵入人体组织、血液，在其中生长和繁殖，引起炎症反应，并导致组织损害、器官功能障碍的病理生理过程。近二三十年来，随着实体器官和造血干细胞移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂等新技术在临床中的广泛应用，使侵袭性真菌病的发病率和病死率逐年升高，已日益成为导致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵袭性真菌病多发于入住icu，高龄，糖尿病，恶性血液系统疾病，念珠菌定植，侵袭性操作，应用抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等人群中，其机体免疫力低下，重症死亡率高，因此对侵袭性真菌感染的早期检测及确定感染菌种有极为重要的意义。

肺孢子菌肺炎(pneumocystispneumonia，pcp)是由耶式肺孢子菌(pneumocystisjirovecii，原名卡式肺孢子菌)引起的呼吸系统真菌感染。耶式肺孢子菌通常寄生在肺泡中，在免疫缺陷者、虚弱的早产儿或营养不良等免疫功能低下者中可能患病，是艾滋病患者最重要的机会性感染，也是艾滋病患者重要的致死原因。

现有的侵袭性真菌感染检测方法主要包括常规检查法和特殊检查法两种。其中常规检查法主要包括：1)真菌显微镜检，即直接涂片染色镜检；2)真菌培养鉴定；3)组织病理学检查。特殊检查法主要包括：1)血清学检查；2)分子生物学检查。其中常规检查法仍被视为确诊侵袭性真菌感染的基石，但其存在敏感度较低，操作繁复，阴性结果不能排除诊断，检测周期较长(通常需要几天到几周的时间)等问题，而导致延误病情及用药，增加死亡率等；血清学检测难以排除真菌某些属的种间抗原抗体交叉反应从而导致误判。相较前两种方法，分子生物学技术具有高特异性和高准确性的优点，并可从基因水平阐明真菌种群之间和中内的分类学关系，因而在近年来越来越得到广泛认可和应用。目前建立的相关分子学诊断方法有普通pcr方法、脉冲场凝胶电泳分型(pfge)、多位点序列分型(mlst)、限制性片段长度多态性分析(rflp)、实时荧光定量pcr技术(rtfq-pcr)等，其共有的问题是对实验操作要求较高，检测时间较长(2.5h-3h左右)。因此，建立快速准确的分子诊断方法，为临床提供早期诊疗依据是解决现状的关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测耶式肺孢子菌的lamp引物组合及其应用。

本发明首先提供引物组合，由引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb组成；

所述引物f3为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物b3为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

所述引物fip为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；

所述引物bip为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链dna分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子；

所述引物lf为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链dna分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子；

所述引物lb为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链dna分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子。

所述引物组合的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):

(b1)鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌；

(b2)制备用于鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌；

(b4)制备用于检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌的试剂盒。

本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):

(b1)鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌；

(b2)制备用于鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌；

(b4)制备用于检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌的试剂盒。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：

(c1)鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌；

(c2)检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌的方法，包括如下步骤：以待测菌的基因组dna为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，如果采用所述引物组组合可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为耶式肺孢子菌；如果采用所述引物组合不能实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，待测菌为非耶式肺孢子菌。

本发明还保护鉴定待测菌是否为耶式肺孢子菌的方法，包括如下步骤：检测待测菌基因组dna中是否含有所述引物组合的靶序列，如果所述基因组dna中含有所述引物组合的靶序列，待测菌为或候选为耶式肺孢子菌；如果所述基因组dna中不含有所述引物组合的靶序列，待测菌为非耶式肺孢子菌。

本发明还保护检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌的方法，包括如下步骤：以待测样本的总dna为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，如果采用所述引物组合可以实现以所述总dna为模板的特异性扩增，待测样本中含有耶式肺孢子菌；如果采用所述引物组合不能实现以所述总dna为模板的特异性扩增，待测样本中不含有耶式肺孢子菌。

本发明还保护检测待测样本中是否含有耶式肺孢子菌的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总dna中是否含有所述引物组合的靶序列，如果所述总dna中含有所述引物组合的靶序列，待测样本中含有耶式肺孢子菌；如果所述总dna中不含有所述引物组合的靶序列，待测样本中不含有耶式肺孢子菌。

以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的反应体系中引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb的摩尔浓度依次为0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。

以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。

以上任一所述待测待测菌具体可为耶式肺孢子菌、烟曲霉、土曲霉、新型隐球菌或加特隐球菌。所述烟曲霉具体可为cgmcc，菌株编号：3.08027的烟曲霉。所述土曲霉具体可为cgmcc，菌株编号：3.08115的土曲霉。所述新型隐球菌具体可为atcc，菌株号：208821的新型隐球菌。所述加特隐球菌可为atcc，菌株号：14248的加特隐球菌。

以上任一所述待测样本具体可为人(homosapiens)的肺泡灌洗液。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的dna聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的碳青霉烯类耐药基因。lamp方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。

本发明提供的引物组合鉴定用于检测常见的六种曲霉菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

图1为实施例1中采用引物组ⅰ的检测结果。

图2为实施例1中采用引物组ⅱ的检测结果。

图3为实施例1中采用引物组ⅲ的检测结果。

图4为实施例1中采用引物组ⅳ的检测结果。

图5为实施例1中采用引物组ⅴ的检测结果。

图6实施例2的检测结果。

图7为实施例3中反应体系1的检测结果。

图8为实施例3中反应体系2的检测结果。

图9为实施例3中反应体系3的检测结果。

图10为实施例3中反应体系4的检测结果。

图11为实施例4的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

反应液为博奥生物集团有限公司产品，产品目录号为cp.440020。

dna拷贝数的计算方法如下：

1a260吸光度值＝dsdna50μg/ml；

核酸浓度＝(od260)×(稀释倍数)×(50)＝xng/μl；

平均分子量(mw)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

摩尔＝6.02×10²³；

平均分子量(mw):dsdna＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；

拷贝数计算公式:

(6.02×10²³copies/摩尔)×(xng/μl×10^-9)/(dna长度×660)＝copies/μl。

实施例1、引物组合的筛选制备

一、引物组合的筛选

1、针对耶式肺孢子菌设计若干引物组合，其中五个引物组合如下：

用于检测耶式肺孢子菌引物组合ⅰ如下(5’→3’)：

引物ⅰ-f3：ttcaactatttctccaga；

引物ⅰ-b3：tgccactgtaatttcc；

引物ⅰ-fip：cgtcaaaaatagactttggttgcaatactgaacggccacca；

引物ⅰ-bip：aatttttttcttggtacccaggacccatgtaacaacataagg；

引物ⅰ-lf：tgagttacattctcaaa；

引物ⅰ-lb：agtttcccacatat。

用于检测耶式肺孢子菌引物组合ⅱ如下(5’→3’)：

引物ⅱ-f3：agctggtacatatgca；

引物ⅱ-b3：attctccaacataagcaa；

引物ⅱ-fip：agcgaatgtcctttatactggaaaaactttatcagcaatagttga；

引物ⅱ-bip：gctatgcctcatcatatgtcttcagttgtacttggaagagaaac；

引物ⅱ-lf：tgtataagtataattaccagt；

引物ⅱ-lb：tgacaatattacagcatct。

用于检测耶式肺孢子菌引物组合ⅲ如下(5’→3’)：

引物ⅲ-f3：atttatttagggctataagt；

引物ⅲ-b3：atacacaagataccatgct；

引物ⅲ-fip：cctttccaaccatcgttaatagtattcgaacaccatcatt；

引物ⅲ-bip：aaatctggctatttcaaaaccaagacccgttatcaagatatt；

引物ⅲ-lf：tttgttatcccattcac；

引物ⅲ-lb：tatgatttcttttcaag。

用于检测耶式肺孢子菌引物组合ⅳ如下(5’→3’)：

引物ⅳ-f3：atcagctggtacatatg；

引物ⅳ-b3：ctccaacataagcaacc；

引物ⅳ-fip：agcgaatgtcctttatactggaaaacaatagttgatggca；

引物ⅳ-bip：gcctcatcatatgtcttcagttgtacttggaagagaaacgt；

引物ⅳ-lf：tatcaaatgtataagtat；

引物ⅳ-lb：tttgacaatattacagc。

用于检测耶式肺孢子菌引物组合ⅴ如下(5’→3’)：

引物ⅴ-f3：tttaatacgagatgttgca；

引物ⅴ-b3：ggcattatcaccgattgt；

引物ⅴ-fip：gcccaagaatgtccagtaaaccaagttcatgattcttattttcc；

引物ⅴ-bip：ggtatatttgagtcgcctgacggaatcccaaaaagcttcattgc；

引物ⅴ-lf：tcaaaggagcgaaaa；

引物ⅴ-lb：agacgaagaatcttcat。

上述的引物组合中，各单链dna均各自独立包装。

上述的引物组合中，引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb的摩尔比均为0.5：0.5：2：2：1：1。

2、以耶式肺孢子菌检测基因质粒dna为模板，分别采用步骤1制备的引物组ⅰ、引物组ⅱ、引物组ⅲ、引物组ⅳ和引物组ⅴ对模板进行环介导等温扩增检测。

耶式肺孢子菌检测基因质粒：在puc57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的saci位点插入genebank号为km056674.1的dna分子，得到重组质粒，该质粒即为耶式肺孢子菌检测基因质粒。

反应体系(10μl)：7.0μl反应液(博奥生物集团有限公司产品，产品目录号：cp.440020)、1μl引物混合物、1μl模板dna(5pg-50pg)，补水至10μl。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，引物f3和引物b3的终浓度均为0.5μm，引物fip和引物bip的终浓度均为2μm，引物lf和引物lb的终浓度均为1μm。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

每个反应体系设置20次重复。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“s型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“s型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

采用引物组ⅰ的检测结果见图1。采用引物组ⅱ的检测结果见图2。采用引物组ⅲ的检测结果见图3。采用引物组ⅳ的检测结果见图4。采用引物组ⅴ的检测结果见图5。

结果显示，引物组合ⅲ的20个重复性好，其它四个引物组合由于在引物设计时引物间距、退火温度等原因致使检测重复性较差，故选择组合ⅲ作为检测耶式肺孢子菌的引物组合。

二、引物组合的制备

用于检测耶式肺孢子菌引物组合如下(5’→3’)：

引物f3(序列1)：atttatttagggctataagt；

引物b3(序列2)：atacacaagataccatgct；

引物fip(序列3)：cctttccaaccatcgttaatagtattcgaacaccatcatt；

引物bip(序列4)：aaatctggctatttcaaaaccaagacccgttatcaagatatt；

引物lf(序列5)：tttgttatcccattcac；

引物lb(序列6)：tatgatttcttttcaag。

引物组合中，各单链dna各自独立包装。

引物组合中，引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物lf和引物lb的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。

实施例2、特异性

一、待测样本的制备

待测样本1：烟曲霉(cgmcc，菌株编号：3.08027)基因组dna；

待测样本2：土曲霉(cgmcc，菌株编号：3.08115)基因组dna；

待测样本3：新型隐球菌(atcc，菌株号：208821)基因组dna；

待测样本4：加特隐球菌(atcc，菌株号：14248)基因组dna；

待测样本5：耶式肺孢子菌检测基因质粒dna；耶式肺孢子菌检测基因质粒：在puc57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的saci位点插入genebank号为km056674.1的dna分子，得到重组质粒，该质粒即为耶式肺孢子菌检测基因质粒。

二、待测样本的检测

以步骤一中的各待测样本为模板，采用实施例1步骤二制备的引物组合进行环介导等温扩增。

反应体系(10μl)：7.0μl反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为cp.440020)、1μl引物混合物、1μl模板dna(5pg-50pg)，补水至10μl。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，引物f3和引物b3的终浓度均为0.5μm，引物fip和引物bip的终浓度均为2μm，引物lf和引物lb的终浓度均为1μm。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

每个反应体系设置20次重复。

结果见图6。结果表明，只有当待测样本为耶式肺孢子菌质粒dna(待测样本5)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“s型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3、4的时候均不显示阳性扩增曲线。

以上结果表明，本发明提供的引物组合对其靶标基因有很高的特异性。

实施例3、灵敏性

待测样本：耶式肺孢子菌检测基因质粒dna；耶式肺孢子菌检测基因质粒：在puc57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的saci位点插入genebank号为km056674.1的dna分子，得到重组质粒，该质粒即为耶式肺孢子菌检测基因质粒。

1、将待测样本用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1步骤二制备的引物组合进行环介导等温扩增。

反应体系(10μl)：7.0μl反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为cp.440020)、1μl引物混合物、1μl稀释液，补水至10μl。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，引物f3和引物b3的终浓度均为0.5μm，引物fip和引物bip的终浓度均为2μm，引物lf和引物lb的终浓度均为1μm。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

根据稀释液中基因组拷贝数的不同，共如下4个反应体系：

反应体系1：1μl稀释液中含有的基因组拷贝数分别为10³；

反应体系2：1μl稀释液中含有的基因组拷贝数分别为5×10²；

反应体系3：1μl稀释液中含有的基因组拷贝数分别为10²；

反应体系4：1μl稀释液中含有的基因组拷贝数分别为10¹。

每个反应体系设置20次重复。

结果见图7-图10。引物组合检测靶标基因在1μl稀释液中基因组拷贝数为10³(图7)和5×10²(图8)时20个检测均可检测出来且重复性好，10²(图9)和10¹(图10)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组合的灵敏度为5×10²个拷贝数/反应体系。

实施例4、临床样本检测

待测样本：已测序鉴定确认含有耶式肺孢子菌的人的肺泡灌洗液。

1、提取待测样本的总dna。

2、以步骤1提取的总dna为模板，采用实施例1步骤二制备的引物组合进行环介导等温扩增。

反应体系与反应条件均同实施例2。

反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

结果见图11。结果显示得到阳性扩增曲线，表明采用本发明的引物组合可以对临床样本中的耶式肺孢子菌进行检测。

结果表明，利用本发明提供的耶式肺孢子菌引物组合可以进行耶式肺孢子菌检测，结果准确可靠。

<110>博奥生物集团有限公司

<120>用于检测耶式肺孢子菌的lamp引物组合及其应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atttatttagggctataagt20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atacacaagataccatgct19

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cctttccaaccatcgttaatagtattcgaacaccatcatt40

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aaatctggctatttcaaaaccaagacccgttatcaagatatt42

<210>5

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tttgttatcccattcac17

<210>6

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tatgatttcttttcaag17