本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体及其制备方法。
背景技术：
基因载体是一种将基因传递进细胞的工具，其主要作用是运载目标基因进入宿主细胞并使其能够成功进行复制和表达，广泛应用于生物医药、细胞工程、酶工程、分子生物学等领域。但是，常见的基因载体不可回收，提高了基因工程的应用成本。基因载体难以回收的主要原因在于基因载体不具有磁响应性，在完成基因转染后，无法在磁场存在的情况下被富集回收。因此，迫切需要研发一种具有磁响应性的基因载体，提高基因载体的可回收性能，降低基因转染的成本。
壳聚糖是一种天然高分子，具有优异的生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等领域的应用研究取得了重大进展。聚乙烯亚胺(PEI)作为阳离子基因传递载体被应用于生物医学研究，但是PEI在提高基因转染效率的同时也增加了细胞毒性，因此其在生物体内的应用受到制约。如何实现PEI的低毒高效基因转染成为一大难题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体，通过内层的四氧化三铁使基因载体获得磁响应性，通过壳聚糖外壳层使基因载体具有高生物相容性，通过聚乙烯亚胺使材料获得高基因转染效率。
本发明的另一目的在于提供上述核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体，包括磁性纳米内核、包覆在磁性纳米内核外的外壳1和外壳2，磁性纳米内核和外壳1紧密配合，外壳1和外壳2紧密配合；磁性纳米内核的材料为Fe3O4，外壳1的材料为壳聚糖(分子式为(C6H11NO4)m)，外壳2的材料为聚乙烯亚胺(分子式为(CH2CH2NH)n)。
核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体中，聚乙酰亚胺表面带有强正电荷(zeta电位>20mV)，而磁性Fe3O4内核带有强负电荷(zeta电位<-20mV)。
上述核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体的制备方法，包括下述步骤：
(1)将可溶性的二价铁盐和三价铁盐、壳聚糖加入反应容器，采用溶剂充分溶解，然后加入试剂A进行反应，得到含有壳聚糖外壳1的磁性Fe3O4；
(2)将含有壳聚糖外壳1的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(分子量为25kDa-750kDa)和戊二醛加入反应容器中，然后加入试剂B，搅拌反应，制得核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体。
步骤(1)中，二价铁盐、三价铁盐和壳聚糖的摩尔质量比1:(1.5～2.5):(1～2)，其中二价铁盐、三价铁盐按铁元素的摩尔质量计，壳聚糖按氨基葡萄糖残基的摩尔质量计；二价铁盐优选为硫酸亚铁、硝酸亚铁、氯化亚铁；三价铁盐优选为硫酸铁、硝酸铁、氯化铁。
步骤(1)，所述溶剂是1％乙酸溶液。
步骤(1)中，所述试剂A是三聚磷酸钠、水和氨水溶液。
步骤(1)中，反应的温度为60～90℃，反应的时间为0.5～3小时。
步骤(2)中，试剂B是1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐。
步骤(2)中，含有壳聚糖外壳1的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺的质量比为1:(1～2)；聚乙烯亚胺和戊二醛的质量比为1:(1～2)；1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐与三种物质(含有壳聚糖外壳1的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺、戊二醛)质量之和的比例为(5～100):1。
步骤(2)中，搅拌反应的温度为30～90℃，时间优选为0.1～24小时。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
(1)本发明的基因载体，具有磁响应特性，增强了基因转染的可导向性，提高基因的转染效率。
(2)本发明的基因载体具有高生物相容性和高基因转染效率。
(3)本发明的基因载体可以回收利用，能降低基因转染的成本。
附图说明
图1为核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
如图1所示，一种核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体，包括磁性纳米内核、包覆在磁性纳米内核外的外壳1和外壳2，磁性纳米内核和外壳1紧密配合，外壳1和外壳2紧密配合；磁性纳米内核的材料为Fe3O4，外壳1的材料为壳聚糖(分子式为(C6H11NO4)m)，外壳2的材料为聚乙烯亚胺(分子式为(CH2CH2NH)n)。
其制备方法是：将可溶性的氯化亚铁和氯化铁以及壳聚糖(按氨基葡萄糖残基算)按照摩尔质量比1:1.5:1加入反应容器，然后加入1％乙酸溶液溶解后，加入三聚磷酸钠、水、氨水，在60℃下反应1h，制得含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4；然后将10g含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4、10g聚乙烯亚胺(分子量为25kDa)和15g戊二醛加入反应容器中，然后加入350g1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐，在30℃下搅拌反应0.1小时，制得核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体。
实施例2
将可溶性的硝酸亚铁和硝酸铁以及壳聚糖(按氨基葡萄糖残基算)按照1：2.5:1摩尔质量比加入反应容器，然后加入1％乙酸溶液溶解后，加入三聚磷酸钠、水，在90℃下反应3h，制得含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4。将10g所得的含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4、15g聚乙烯亚胺(分子量为25kDa)和30g戊二醛加入反应容器中，然后加入2750g1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐，在60℃下搅拌反应18小时，制得核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体。
实施例3
将可溶性的硫酸亚铁和硝酸铁以及壳聚糖(按氨基葡萄糖残基算)按照1：2.5:1摩尔质量比加入反应容器，然后加入1％乙酸溶液溶解后，加入三聚磷酸钠、水，在75℃下反应1.5h，制得含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4。将10g所得的含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4、10g聚乙烯亚胺(分子量为750kDa)和20g戊二醛加入反应容器中，然后加入4000g1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐，在90℃下搅拌反应24小时，制得核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体。
实施例4
将可溶性的氯化亚铁和硫酸铁以及壳聚糖(按氨基葡萄糖残基算)按照1：1.5:.1.5摩尔质量比加入反应容器，然后加入1％乙酸溶液溶解后，加入加入三聚磷酸钠、水，在60℃下反应3h，制得含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4。将所得的10g含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4、10g聚乙烯亚胺(分子量为200kDa)和10g戊二醛加入反应容器中，然后加入300g1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐，在30℃下搅拌反应6小时，制得核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体。
实施例5
将可溶性的硝酸亚铁和硫酸铁以及壳聚糖(按氨基葡萄糖残基算)按照1：2:1.5摩尔质量比加入反应容器，然后加入1％乙酸溶液溶解后，加入加入三聚磷酸钠、水，在90℃下反应1h，制得核含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4。将所得的10g含有壳聚糖外壳的磁性Fe3O4、20g聚乙烯亚胺(分子量为25kDa)和20g戊二醛加入反应容器中，然后加入250g1-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐，在80℃下搅拌反应18小时，制得核壳结构的磁性壳聚糖聚乙酰亚胺纳米基因载体。