一种转基因烟草多重荧光PCR基因位点、引物及其检测方法与流程

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种转基因烟草多重荧光pcr基因位点、引物及其检测方法。

背景技术：

1983年，世界上首例转基因作物也即是转基因烟草在美国研发成功；1994年，美国monsanto公司的延熟保鲜转基因西红柿在美国批准上市；数十年来，转基因作物在世界范围内广泛应用，也引起了无数争议。

我国发布的转基因烟草的相关规范有国烟法[1998]168号《烟草基因工程研究及其应用管理办法》、国烟科[2003]387号《国家烟草专卖局关于加强对转基因烟草监控的通知》及在2005至2006年还陆续传达了加强出口烟草转基因检测的几个文件。由于烟草作为转基因模式作物，研究最早、范围较广，因而在部分检测机构抽检中也有发现。目前pcr技术是检测和鉴定转基因产品的主流方法，通过在样品dna中检测某外源基因，从而判定样品是否含有该转基因成分。

样品中dna的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。

种子和新鲜烟叶dna损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常dna纯度od260/od280为1.6至1.8，浓度在ng/μl级，可略作稀释或直接用于pcr检测。

烤后烟叶和卷烟dna损失大且碎片化，自动化、半自动化的方法得率较低；通常采用手动提取的方法。因为样品种类、研究方式区别很大，手动提取的方法也种类广泛、差异显著，效果因而参差不齐。

第一代pcr技术，通常称为普通pcr技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品dna和引物及扩增试剂混匀后通过pcr仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代pcr技术为实时定量荧光pcr，通常简称荧光pcr。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光pcr仪(通常简称荧光pcr仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通pcr，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。

多重实时定量荧光pcr(以下简称多重荧光pcr)属于荧光pcr的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光pcr仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光pcr，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。

中国专利数据库中涉及转基因成分鉴定的pcr技术的专利申请件已有百余件，但多为普通pcr方法和荧光pcr方法，利用多重荧光pcr技术对烟草转基因的研究在国内还是空白，因此，提供一种多重荧光pcr检测烟草转基因的方法是目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种转基因烟草多重荧光pcr基因位点、引物及其检测方法，其目的在于提供一种高效率，低成本，检测结果准确的转基因烟草的检测方法。

其具体技术方案如下：

本发明选定的具体内源基因和外源基因包括：

(1)内源基因：nr，英文名：nicotianatabacumnitratereductase；中文名：烟草硝化还原酶。

(2)外源基因/通用元件：camv35s，英文名：35promoterformcauliflomermosaicvirus；中文名：花椰菜花叶病毒35s启动子。

(3)外源基因/通用元件：nos，英文名：nopalinesynthaseterminator；中文名：胭脂碱合成酶3’转录终止子。

(4)外源基因/通用元件：nptii，英文名：neomycinphosphotransferaseii；中文名：新霉素-3’-磷酸转移酶。

(5)外源基因/品系基因：btc，英文名：bacillusthuringiensiscryia(b)/cryia(c)fusiongene；中文名：编码苏云金芽孢杆菌cryia(b)和cryia(c)杀虫晶体蛋白基因经人工拼接形成的基因。

(6)外源基因/品系基因：cpti，英文名：cowpeatrypsininhibitor；中文名：豇豆胰蛋白酶抑制剂。

(7)外源基因/品系基因：epsps，英文名：5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase；中文名：5-莽草酸-3-磷酸合成酶。

(8)外源基因/品系基因：cmv-cp，英文名：cucumbermosaicviruscoatprotein；中文名：烟草花叶外壳蛋白。

(9)外源基因/品系基因：pvy-cp，英文名：potatoyviruscoatprotein；中文名：马铃薯y病毒外壳蛋白。

(10)外源基因/品系基因：tmv-cp，英文名：tobaccomosaicviruscoatprotein；中文名：烟草花叶病毒外壳蛋白。

(11)外源基因/品系基因：cmv-sat，英文名：cucumbermosaicvirusmicrosatelliterna；中文名：黄瓜花叶病毒微卫星rna。

(12)外源基因/品系基因：pvy-nib，英文名：potatoyvirusnuclearinclusionb；中文名：马铃薯y病毒复制酶。

(13)外源基因/品系基因：tmv-54kd，英文名：tobaccomosaicvirus54kdprotein；中文名：烟草花叶病毒复制酶。

本发明提供了一种检测转基因烟草的多重荧光pcr基因位点，包括：

nr基因：检测位点为检测位点为ncbi的genbank中jn384020.1的501至630bp。

btc基因：检测位点为ncbi的genbank中eu816953.1的eu816953.1的540至657bp。

cpti基因：检测位点为ncbi的genbank中aj271752.1的aj271752.1的599至720bp。

epsps基因：检测位点为ncbi的genbank中ay592954.1的ay592954.1的243至614bp。

cmv-cp基因：检测位点为ncbi的genbank中kj513406.1的kj513406.1的312至436bp。

pvy-cp基因：检测位点为ncbi的genbank中kx376949.1的kx376949.1的317至407bp。

tmv-cp基因：检测位点为ncbi的genbank中kj508033.1的kj508033.1的285至424bp。

cmv-sat基因：检测位点为ncbi的genbank中ef363687.1的ef363687.1的224至358bp。

pvy-nib基因：检测位点为ncbi的genbank中ef470240.1的ef470240.1的1305至1453bp。

tmv-54d基因：检测位点为ncbi的genbank中x66047.1的x66047.1的559至651bp。

多重荧光pcr基因位点还包括camv35s、nptii、nos基因位点为通用的基因位点。

本发明设计内源基因和品系基因的引物和探针时，在ncbi的genbank中检索到数十条相关序列，运用lasergenev7.1.0的megalign比对出保守区域，利用oligov7.0.2设计引物和探针，先用ncbi的primer-blast进行验算，最后进行实际验证。

本发明针对上述多重荧光pcr基因位点还提供了一种检测转基因烟草的多重荧光pcr引物，包括：

针对上述多重荧光pcr基因位点的nr基因的单重引物，btc、cpti、epsps基因的三重引物，cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp基因的三重引物，cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd基因的三重引物；

所述nr基因的引物为：seqidno.1和seqidno.2；

所述btc基因的引物为：seqidno.9和seqidno.10；

所述cpti基因的引物为：seqidno.11和seqidno.12；

所述epsps基因的引物为：seqidno.13和seqidno.14；

所述cmv-cp基因的引物为：seqidno.15和seqidno.16；

所述pvy-cp基因的引物为：seqidno.17和seqidno.18；

所述tmv-cp基因的引物为：seqidno.19和seqidno.20；

所述cmv-sat基因的引物为：seqidno.21和seqidno.22；

所述pvy-nib基因的引物为：seqidno.23和seqidno.24；

所述tmv-54kd基因的引物为：seqidno.25和seqidno.26。

多重荧光pcr引物还包括camv35s、nptii、nos基因的三重引物，

camv35s基因的引物为：seqidno.3和seqidno.4；

nptii基因的引物为：seqidno.5和seqidno.6；

nos基因的引物为：seqidno.7和seqidno.8；

本发明还提供了一种检测转基因烟草的多重荧光pcr探针，其特征在于，包括nr基因的单重探针，btc、cpti、epsps基因的三重探针，cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp基因的三重探针，cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd基因的三重探针；

所述nr基因的探针为seqidno.27，荧光探针修饰为：5’-fam，3’-mgb；

所述btc基因的探针为seqidno.31，荧光探针修饰为：5’-fam，3’-mgb；

所述cpti基因的探针为seqidno.32，荧光探针修饰为：5’-hex，3’-mgb；

所述epsps基因的探针为seqidno.33，荧光探针修饰为：5’-tamra，3’-mgb；

所述cmv-cp基因的探针为seqidno.34，荧光探针修饰为：5’-fam，3’-mgb；

所述pvy-cp基因的探针为seqidno.35，荧光探针修饰为：5’-hex，3’-mgb；

所述tmv-cp基因的探针为seqidno.36，荧光探针修饰为：5’-tamra，3’-mgb；

所述cmv-sat基因的探针为seqidno.37，荧光探针修饰为：5’-fam，3’-mgb；

所述pvy-nib基因的探针为seqidno.38，荧光探针修饰为：5’-hex，3’-mgb；

所述tmv-54kd基因的探针为seqidno.39，荧光探针修饰为：5’-tamra，3’-mgb。

多重荧光pcr探针还包括camv35s、nptii、nos基因的三重探针，camv35s基因的探针为seqidno.28，荧光探针修饰为：5’-fam，3’-mgb；

nptii基因的探针为seqidno.29，荧光探针修饰为：5’-hex，3’-mgb；

nos基因的探针为seqidno.30，荧光探针修饰为：5’-tamra，3’-mgb；

本发明还提供了一种检测转基因烟草多重荧光pcr的方法，所述转基因烟草选自种子、新鲜烟叶、烤后卷烟或卷烟。

优选地，该方法包括以下步骤：

步骤1：进行样品处理，提取样品dna；

步骤2：建立包括权利要求2所述引物探针的多重荧光pcr反应体系，反应条件为：95℃20-120s或10-15min；95℃5-60s，60℃20-120s，40个循环，收集荧光信号；

步骤3：烟草转基因成分检测结果的判断。

优选地，所述步骤1具体为：

当所述样品为种子和新鲜烟叶时，使用自检工作站、核酸提取仪、试剂盒、ctab法、sds法提取样品dna；

当所述样品为烤后烟叶和卷烟时，采用以下步骤提取样品dna：

样品粉碎，加入正己烷和ctab抽提液，混匀，静止至水相和有机相明显分层，离心，将水相和有机相明显分层，取水相，将水相离心后取上清水相，提取dna，再将dna样品浓缩以作后续检测。

优选地，所述样品粉碎后的质量为不小于10g；

所述正己烷的用量为与样品体积相同；

所述ctab抽提液的用量为20ml；

所述将水相和有机相离心的转速不小于3krpm，离心的时间不小于10min；

所述将水相离心的转速不小于6krpm，离心的时间不小于10min；

所述dna样品浓缩的体积为10–100μl。

多重荧光pcr仪上进行扩增和检测的方法是选择25μl或50μl体系进行反应体系的配制，分别配制针对nr基因的单重反应体系a，针对camv35s、nptii、nos基因的三重反应体系b、针对btc、cpti、epsps基因的三重反应体系c，针对cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp基因的三重反应体系d，针对cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd基因的三重反应体系e，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定。为便于理解判断条件，先简要阐述相关定义。

荧光信号检测基因：体系a中fam荧光信号检测nr基因，体系b中fam、hex、tamra荧光信号分别检测camv35s、nptii、nos基因，体系c中fam、hex、tamra荧光信号分别检测btc、cpti、epsps基因，体系d中fam、hex、tamra荧光信号分别检测cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp基因，体系e中fam、hex、tamra荧光信号分别检测cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd基因。

荧光信号检测阳性：fam或hex或tamra有荧光对数增长且ct值≤30.0；或30.0<ct值<40.0且复检后ct值<40.0，此两种情况均为该荧光信号检测阳性。

荧光信号检测阴性：fam或hex或tamra有荧光对数增长且ct值≥40.0；或30.0<ct值<40.0且复检后ct值≥40.0，此两种情况均为该荧光信号检测阴性。

优选地，所述步骤3的判断方法具体为：

(1)质控标准：阳性对照的nr、camv35s、nptii、nos、btc、cpti、epsps、cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp、cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，ct值≥40.0，进行(2)的烟草成分检测；

(2)烟草成分检测：样品nr检测阴性，表明该样品中不含烟草dna，或烟草dna含量不足以进行转基因成分检测和判定；样品nr检测阳性，表明该样品中含有烟草dna，进行(3)的转基因成分判定；

(3)转基因成分判定：camv35s或/和nptii或/和nos检测阴性，表明该样品未检出camv35s或/和nptii或/和nos转基因成分；camv35s或/和nptii或/和nos检测阳性，表明该样品检出camv35s或/和nptii或/和nos转基因成分，进行(4)的品系鉴定；

(4)品系鉴定：btc或/和cpti或/和epsps或/和cmv-cp或/和pvy-cp或/和tmv-cp或/和cmv-sat或/和pvy-nib或/和tmv-54kd检测阴性，表明该样品含有btc或/和cpti或/和epsps或/和cmv-cp或/和pvy-cp或/和tmv-cp或/和cmv-sat或/和pvy-nib或/和tmv-54kd品系基因；btc或/和cpti或/和epsps或/和cmv-cp或/和pvy-cp或/和tmv-cp或/和cmv-sat或/和pvy-nib或/和tmv-54kd检测阳性，表明该样品含有btc或/和cpti或/和epsps或/和cmv-cp或/和pvy-cp或/和tmv-cp或/和cmv-sat或/和pvy-nib或/和tmv-54kd品系基因。

可将反应体系a、b、c、d、e一并配制后按反应条件同时检测，从而提高检测效率；也可先配制反应体系a进行检测，若结果为阳性再配制反应体系b进行检测，若结果为阳性又配制反应体系c、d、e进行检测，从而节省操作和试剂。

发明人根据当前文献报道和标准制修订情况及相关研究情况，筛选nr基因为烟草内源基因，camv35s、nptii、nos为转基因烟草的通用元件，检测范围可覆盖当前绝大多数商业转基因烟草及产品。在品系鉴定上，常见转基因烟草性状通常通过btc、cpti、epsps、cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp、cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd等一个或多个外源功能基因进行表达，本申请件就通过相应基因检测进行品系鉴定。由于转基因技术发展迅速、处于实验研究中的转基因烟草品系众多，本发明通过采用上述内源基因、通用元件和功能基因相结合，有利于不同品系烟草转基因成分的充分检出。

此外，需要指出的是：本方法中阴性对照标明为非转基因源性且非烟草源性dna，如非转基因动物dna、除烟草外的非转基因植物dna等，来源广泛、便于制备。但需要注意：camv35s、nptii、nos、btc、cpti、epsps、cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp、cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd等基因也是分别从自然界中的对应物种中获得后应用于基因工程的，请勿故意使用上述对应物种dna作为阴性对照，导致实验失败。

本发明还提供了一种检测转基因烟草多重荧光pcr的试剂盒，包括上述一种检测转基因烟草的多重荧光pcr引物提供的所述pcr引物、一种检测转基因烟草的多重荧光pcr探针提供的所述pcr探针、荧光pcr试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照。

优选地，所述阳性对照为为上述多重荧光pcr引物可进行扩增且pcr探针能进行检测的dna片段，浓度为10⁵copies/μl级；

所述权利要求2所述的pcr探针的浓度均为10μmol/l；

所述权利要求1所述的pcr引物的浓度均为10μmol/l；

所述阴性对照为非转基因源性且非烟草源性dna；

所述空白对照为3dh2o。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

(1)本发明将烟草转基因品系的内源和特定外源基因同时用于设计特异性的引物探针组，各引物探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，特异性好，检测灵敏度高。

(2)本发明相对现有相关标准sn/t1200-2003《烟草中转基因成分定性pcr检测方法》的普通pcr法、gb/t24310-2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》的荧光pcr法、普通pcr法、巢式pcr法、半巢式pcr法混用，统一为多重荧光pcr法同时检测多个目的基因，提升检测效率，且便于检测人员实际运用。

(3)本发明根据cry1ab和cry1ac的融合基因cry1a(b)/(c)即btc基因设计引物探针，相对gb/t24310-2009中cry1ac的覆盖面更广。此外，本发明中探针长度均在15-25bp正常范围，相对gb/t24310-2009中nr基因探针40bp，特异性有一定提升。最后，选用无荧光的nfq-mgb作为淬灭基团，相对有荧光的tamra特异性更强。

(4)本发明提供的检测方法有利于不同品系烟草转基因成分的充分检出，相对多重pcr方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为10⁵级时，定量标准误差在10⁴级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μl级)的优点；相对荧光pcr方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通pcr方法，兼具上述两种优点。

(5)本发明的试剂盒在选用适于多重荧光pcr引物体系的外购的试剂套装时，选择带热敏taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；所述荧光pcr试剂中包括rox染料，对于需要rox染料的多重荧光pcr仪可提升检测准确性。

(6)本发明提供的引物、探针、试剂盒和方法已应用于本单位相关科研中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间70％以上、节约试剂成本70％以上，具有较好的实用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例一种转基因烟草多重荧光pcr基因位点、引物及其检测方法的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下就本发明所提供的一种转基因烟草多重荧光pcr基因位点、引物及其检测方法做进一步说明。

本发明提供检测烟草转基因成分的多重荧光pcr引物探针组具体如表1所示：包括针对nr基因的单重引物探针组，针对camv35s、nptii、nos基因的三重引物探针组、针对btc、cpti、epsps基因的三重引物探针组，针对cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp基因的三重引物探针组，针对cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd基因的三重引物探针组。

表1引物探针对照表

实施例一检测烟草转基因成分的多重荧光试剂盒的构建及验证

(1)引物探针组：如表2所示，可通过具有引物和探针合成能力的公司合成，本实施例选择上海生工生物工程技术服务有限公司合成，将引物和探针干粉稀释至100μmol/l作为储备液，按照表1配制成10μmol/l作为使用液。

表2100μmol/l储备液配制为10μmol/l使用液

*：分别用1.5ml透明离心管封装；#：分别用1.5ml黑色离心管封装。

(2)荧光pcr试剂：常见市售荧光pcr试剂，本实施例选择path-id^tmqpcrmastermix。

(3)阳性对照：取全部引物储备液，分别稀释至10μmol/l。提取含有nr、camv35s、nptii、nos、btc、cpti、epsps、cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp、cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd的转基因烟草品系dna，用对应引物和普通pcr试剂在普通pcr仪上进行扩增，将目的条带切胶回收后转入takarat-vectorpmd^tm20载体，用感受态e.coli细胞jm109复制，提取pmt-20质粒，分别稀释至10⁷copies/μl级浓度，各取1μl混匀后用3dh2o定容至100μl，终浓度即为10⁵copies/μl级。

(4)阴性对照：选择非转基因且非烟草源性dna。

(5)空白对照：3dh2o。

(6)多通道荧光pcr仪选用abiquantstudio5，验证样品特征如表3、按表4进行反应液配制、按表5进行反应。

表3样品特征

表425μl反应体系(单位：μl)

表5反应条件

(7)反应结果如图1和表6所示：

图1中，曲线1至13、曲线14至26、曲线27至39、曲线40至52分别为阳性对照、阴性对照、加标对照、空白对照的nr(fam)、camv35s(fam)、nptii(hex)、nos(tamra)、btc(fam)、cpti(hex)、epsps(tamra)、cmv-cp(fam)、pvy-cp(hex)、tmv-cp(tamra)、cmv-sat(fam)、pvy-nib(hex)、tmv-54kd(tamra)的荧光信号。

表6样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线

(8)验证结果：与按照gb/t24310-2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》对样品进行转基因烟草成分检测的结果相符。通过阳性对照、加标对照、阴性对照、空白对照的设置，表明试剂盒成分有效，且特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本。

实施例二btc/cpti/epsps、cmv-cp/pvy-cp/tmv-cp、cmv-sat/pvy-nib/tmv-54kd三种转基因烟草品系样品的检测

从贵州省农科院获赠btc/cpti/epsps、cmv-cp/pvy-cp/tmv-cp、cmv-sat/pvy-nib/tmv-54kd三种转基因烟草品系种子及新鲜烟叶，依次编为#1、#2、#3样品。将样品球磨粉碎后使用外购dna提取试剂盒(qiagenmagattracthmwdnakit)在小型磁力架(qiagenmagattractmagneticrack)上提取样品dna；dna纯度均为od260/od280＝1.79，浓度分别为182.7ng/μl、150.3ng/μl、194.6ng/μl，-20℃保存。之后将dna分别稀释至50ng/μl进行检测，引物针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光pcr试剂为multiplexpcrkit，上机检测(abi荧光pcr仪，型号为steponeplus)。

检测结果见表7和表8：

(1)质控标准：阳性对照的nr、camv35s、nptii、nos、btc、cpti、epsps、cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp、cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，ct值≥40.0，可进行样品成分检测。

(2)所有样品nr检测阳性，表明所有样品中含有烟草dna，可进行转基因成分判定。

(3)所有样品camv35s和nptii和nos阳性，表明所有样品检出camv35s和nptii和nos转基因成分，可再进行品系鉴定。

(4)#1烟草样品btc(fam)、cpti(hex)、epsps(tamra)检测阳性，表明该样品含有btc、cpti、epsps品系基因。

(5)#2烟草样品cmv-cp(fam)、pvy-cp(hex)、tmv-cp(tamra)检测阳性，表明该样品含有cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp品系基因。

(6)#3烟草样品cmv-sat(fam)、pvy-nib(hex)、tmv-54kd(tamra)检测阳性，表明该样品含有cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd品系基因。

(7)比对结果：与按照gb/t24310-2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》对样品进行转基因烟草成分检测的结果相符。

表7对照检测结果：实测ct值及有无s型曲线

表8样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线

实施例三非转基因烟草品系样品的检测

从贵州省质检院获赠非转基因烟草样品(烤后烟叶粉末)。(1)样品用球磨机粉碎，处理后质量10.0g；(2)加入10ml正己烷、20mlctab抽提液，在空气摇床中120rpm、匀质6h，间或颠倒混匀；(3)10krpm、10min离心使水相和有机相明显分层，移去有机相并移取水相；(4)将所得水相10krpm、10min离心，移取上清水相；(5)用大体积dna提取试剂盒(qiagendneasyplantmaxikit)进行dna提取；(6)再通过柱膜浓缩管(milliporemicrocondnafastflow(pcrgrade))浓缩dna样品至10μl，dna纯度为od260/od280＝1.71、dna浓度为8.60ng/μl，-20℃保存。

引物组、探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光pcr试剂为abitaqman^tmenvironmentalmastermix2.0，上机检测(abi荧光pcr仪，型号为7500fast)。

检测结果见表9：

(1)质控标准：阳性对照的nr、camv35s、nptii、nos、btc、cpti、epsps、cmv-cp、pvy-cp、tmv-cp、cmv-sat、pvy-nib、tmv-54kd均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，ct值≥40.0，可进行样品成分检测。

(2)样品nr检测阳性，表明样品中含有烟草dna，可进行转基因成分判定。

(3)样品camv35s和nptii和nos阴性，表明所有样品未检出camv35s和nptii和nos转基因成分，应为非转基因烟草，无需再进行品系鉴定。

表9样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线

综上所述，本发明提供的多重荧光pcr引物、探针、方法及试剂盒仅对烟草和转基因烟草的目的基因进行特异性扩增，并在扩增中产生荧光信号，可有效适用于烟草相关产品的转基因成分检测，与相关标准检测方法的结果相符，节约了检测时间，降低了检测成本，具有较好的实用价值。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110>贵州中烟有限责任公司

<120>一种转基因烟草多重荧光pcr基因位点、引物及其检测方法

<160>39

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtctttcaagcctcggtct19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<212>dna

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<400>9

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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gattatacgatccggttcct20

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<212>dna

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cccgctcagtttgctaacagacc23

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<213>人工序列(artificialsequence)

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ctccgtttggattgaagtgt20

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ttcccttcctgcgctattgttg22

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>39

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