本发明属于生物技术领域，特别涉及一种米曲霉转化铁棍山药生产薯蓣皂苷元的方法。
背景技术：
薯蓣皂苷元是合成治疗心血管疾病药物、甾体激素类药物和避孕类药物的重要原料，应用前景十分广泛，并且越来越多研究表明，薯蓣皂苷元具有诱导结肠癌和骨肉瘤细胞凋亡、抗高脂血症、抗血小板聚集、抗艾滋病、抗动脉硬化等多种功效。目前工业上主要采用酸水解法生产薯蓣皂苷元，此种方法是先以强酸水解薯蓣皂苷糖苷键，再以有机溶剂萃取皂苷元。而在传统的工艺生产过程中，有大量酸性废水产生，严重污染环境。对此国内外已经开始尝试探索利用微生物法制备薯蓣皂苷元。微生物转化是利用微生物对外源性化合物进行结构修饰的化学反应，具有反应条件温和、程序简单、产品纯度高，以及不污染环境的特点。
目前也有一些利用微生物转化生产薯蓣皂苷元的专利，如：一种薯蓣皂苷青霉菌及其制备方法、一种利用盾叶薯蓣内生镰孢菌寡糖提高培养细胞薯蓣皂苷元产率的方法、采用一株米根霉提取薯蓣皂苷的环保提取工艺、穿龙薯蓣内生真菌及其应用、一株高效转化黄姜皂苷的菌株及其应用、一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物发酵生产薯蓣皂素的方法、一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌及应用、一株产薯蓣皂苷元的产气肠杆菌clx-74菌株及其用途、生物催化制备薯蓣皂苷元的方法及其所用菌剂。关于微生物转化生产薯蓣皂苷元的专利不多，且存在一些缺陷，如米根霉的转化率低，薯蓣皂苷元含量只有2.79％，个别专利采用了联合顺序发酵方式，方法复杂，且发酵时间长达46天。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术中的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种米曲霉转化铁棍山药生产薯蓣皂苷元的方法，该方法提高了薯蓣皂苷元的转化率。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种米曲霉转化铁棍山药生产薯蓣皂苷元的方法，包括以下具体步骤：
s1.制备米曲霉转化培养基：米曲霉转化培养基以铁棍山药粉作为米曲霉生长的主要碳源，以四环素作为抑菌剂，再加入维生素、生物素、生物小分子物质、无机盐和矿物质用以支持米曲霉生长；
s2.筛选米曲霉：包括菌种初筛和菌种复筛；菌种初筛是将米曲霉接种至平板初筛培养基，挑取平板初筛培养基上生长的单菌落再次划线在平板初筛培养基上，第三次平板划线直至分离出单菌落；菌种复筛是将菌种初筛最后分离得到的单菌落接种到复筛培养基中进行培养；
s3.接种、培养米曲霉：将s2中菌种复筛所得米曲霉接种到s1中的转化培养基中进行发酵培养；
s4.将经过s3发酵培养产生了薯蓣皂苷元的米曲霉细胞通过离心或者过滤从培养基中分离出来；
s5.菌体分离后加入石油醚浸泡，离心后取石油醚相，室温静置结晶，获得米曲霉转化铁棍山药生产薯蓣皂苷元。
s1中所述的米曲霉转化培养基中含有3.00g/l硝酸钠，1.00g/l磷酸二氢钾，0.50g/l七水硫酸镁，0.50g/l氯化钾，0.01g/l七水硫酸铁，3.00g/l铁棍山药粉，0.02g/l四环素，0.1g/l维生素b12，5.5g/l甘氨酸，0.5g/l纤维素酶，0.5g/lα-淀粉酶。
米曲霉转化培养基中以铁棍山药粉作为米曲霉生长的主要碳源，其中铁棍山药粉中含多种皂苷类物质供米曲霉转化；
s2中所述的平板初筛培养基中添加硝酸钠3.00g/l，磷酸二氢钾1.00g/l，七水硫酸镁0.50g/l，氯化钾0.50g/l，七水硫酸铁0.01g/l，铁棍山药粉3.00g/l，琼脂粉20.00g/l。
s2中所述的复筛培养基为液体培养基，含有硝酸钠3.00g/l，磷酸二氢钾1.00g/l，七水硫酸镁0.50g/l，氯化钾0.50g/l，七水硫酸铁0.01g/l，铁棍山药粉3.00g/l。
s2中所述的菌种初筛的培养温度为28℃～30℃，培养时间为48h。
s2中所述的菌种复筛是将菌种初筛最后分离得到的单菌落挑取一环于10ml无菌生理盐水中，用混匀器混匀，移液枪移取4ml菌液到复筛培养基中，以180r/min的转速，30℃摇床振荡培养5天。
s3所述米曲霉的接种量为6％；所述发酵培养的培养温度为28℃～35℃，培养时间为6d，在转速为180r/min摇床振荡培养。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明是在现有技术上进行进一步改进，利用米曲霉转化铁棍山药中的薯蓣皂苷生产薯蓣皂苷元，优化生产条件，为提高薯蓣皂苷元得率和品质，解决传统工艺中存在的环境污染等问题提供一种新方法。
(2)本发明可通过温和的方式修饰薯蓣皂苷结构，转化生成薯蓣皂苷元，取代酸水解，不产生废水，可降低能耗、减少环境污染。
(3)本发明在发酵培养基中添加了纤维素酶和淀粉酶，使得“包裹”在薯蓣皂苷外的淀粉和纤维素有一定程度的降解，从而使得薯蓣皂苷更易溶出，方便米曲霉转化，提高薯蓣皂苷元的转化率；采用本发明方法，铁棍山药粉中转化生成薯蓣皂苷元的转化率达到71.57％。
(4)本发明使用的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，操作简单，且发酵成本较低，时间短，不受时域、季节等条件限制。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中使用的平板初筛培养基中添加硝酸钠3.00g/l，磷酸二氢钾1.00g/l，七水硫酸镁0.50g/l，氯化钾0.50g/l，七水硫酸铁0.01g/l，铁棍山药粉3.00g/l，琼脂粉20.00g/l。
以下实施例中使用的复筛培养基为液体培养基，含有硝酸钠3.00g/l，磷酸二氢钾1.00g/l，七水硫酸镁0.50g/l，氯化钾0.50g/l，七水硫酸铁0.01g/l，铁棍山药粉3.00g/l。
实施例1：
(1)制备米曲霉转化培养基：加入铁棍山药粉作为米曲霉生长的主要碳源，含量为3.00g/l，其中铁棍山药粉中含多种皂苷类物质供米曲霉转化。培养基中添加四环素防止染上杂菌，含量为0.02g/l；培养基中加入可支持米曲霉生长的维生素、生物素、生物小分子物质、无机盐、矿物质；该培养基中含有3.00g/l硝酸钠，1.00g/l磷酸二氢钾，0.50g/l七水硫酸镁，0.50g/l氯化钾，0.01g/l七水硫酸铁，3.00g/l铁棍山药粉，0.02g/l四环素，0.1g/l维生素b12，5.5g/l甘氨酸，0.5g/l纤维素酶，0.5g/lα-淀粉酶；
(2)将米曲霉接种至平板初筛培养基，28℃生化培养箱培养4～7d，观察各菌株生长结果；将能在初筛培养基上生长的形态不同的单菌落挑取再次划线在平板上后，第三次平板划线直至分离出单菌落；
(3)将能够在初筛平板培养基上生长或者分离得到的单菌落挑取一环于10ml无菌生理盐水中，用混匀器混匀，移液枪移取4ml菌液到发酵培养基中，以180r/min的转速，30℃摇床振荡培养5天；
(4)将筛选出的米曲霉接种到转化培养基中培养，接种量为6％，发酵温度为30℃。培养时间为6d，在转速为，180r/min摇床振荡培养。
(5)菌体分离后加入石油醚浸泡，离心后取石油醚相，室温静置结晶，对结晶产物进行质谱和核磁共振分析，测量薯蓣皂苷元生成的含量，总皂若的转化率可达到71.57％。hplc测定其纯度可达96.5％。
实施例2：
(1)制备米曲霉转化培养基。加入铁棍山药粉作为米曲霉生长的主要碳源，含量为3.00g/l，其中铁棍山药粉中含多种皂苷类物质供米曲霉转化。培养基中添加四环素防止染上杂菌，含量为0.02g/l；培养基中加入可支持米曲霉生长的维生素、生物素、生物小分子物质、无机盐、矿物质；该培养基中含有3.00g/l硝酸钠，1.00g/l磷酸二氢钾，0.50g/l七水硫酸镁，0.50g/l氯化钾，0.01g/l七水硫酸铁，3.00g/l铁棍山药粉，0.02g/l四环素，0.1g/l维生素b12，5.5g/l甘氨酸，0.5g/l纤维素酶，0.5g/lα-淀粉酶；
(2)将米曲霉接种至平板初筛培养基，28℃生化培养箱培养4～7d，观察各菌株生长结果；将能在初筛培养基上生长的形态不同的单菌落挑取再次划线在平板上后，第三次平板划线直至分离出单菌落。
(3)将能够在初筛平板培养基上生长或者分离得到的单菌落挑取一环于10ml无菌生理盐水中，用混匀器混匀，移液枪移取4ml菌液到发酵培养基中，以180r/min的转速，30℃摇床振荡培养5天；
(4)将筛选出的米曲霉接种到转化培养基中培养，接种量为6％，发酵温度为32℃。培养时间为6d，在转速为，180r/min摇床振荡培养。
(5)菌体分离后加入石油醚浸泡，离心后取石油醚相，室温静置结晶，对结晶产物进行质谱和核磁共振分析，测量薯蓣皂苷元生成的含量，总皂若的转化率可达到70％以上。
实施例3：
(1)制备米曲霉转化培养基。加入铁棍山药粉作为米曲霉生长的主要碳源，含量为3.00g/l，其中铁棍山药粉中含多种皂苷类物质供米曲霉转化。培养基中添加四环素防止染上杂菌，含量为0.02g/l；培养基中加入可支持米曲霉生长的维生素、生物素、生物小分子物质、无机盐、矿物质；该培养基中含有3.00g/l硝酸钠，1.00g/l磷酸二氢钾，0.50g/l七水硫酸镁，0.50g/l氯化钾，0.01g/l七水硫酸铁，3.00g/l铁棍山药粉，0.02g/l四环素，0.1g/l维生素b12，5.5g/l甘氨酸，0.5g/l纤维素酶，0.5g/lα-淀粉酶；
(2)将米曲霉接种至平板初筛培养基，28℃生化培养箱培养4～7d，观察各菌株生长结果；将能在初筛培养基上生长的形态不同的单菌落挑取再次划线在平板上后，第三次平板划线直至分离出单菌落；
(3)将能够在初筛平板培养基上生长或者分离得到的单菌落挑取一环于10ml无菌生理盐水中，用混匀器混匀，移液枪移取4ml菌液到发酵培养基中，以180r/min的转速，30℃摇床振荡培养5天；
(4)将筛选出的米曲霉接种到转化培养基中培养，接种量为6％，发酵温度为35℃。培养时间为6d，在转速为，180r/min摇床振荡培养。
(5)菌体分离后加入石油醚浸泡，离心后取石油醚相，室温静置结晶，对结晶产物进行质谱和核磁共振分析，测量薯蓣皂苷元生成的含量，总皂若的转化率可达到70％以上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。