本发明涉及一组鉴定鳖甲的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域。
背景技术：
鳖甲(trionyciscarapax)，为鳖科动物鳖(pelodiscussinensis)的背甲，是一种传统中药，始记载于《神农本草经》，被列为中品。历代本草均有记载，现被国家卫生局列为药食两用类中药。鳖甲性微寒，味咸，归肝、肾经，能滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结。主治阴虚发热，骨蒸劳热，阴虚阳亢，头晕目眩，虚风内动，手足瘈疭，经闭，癥瘕，久疟疟母等。
鳖甲为临床常用中药，由于同名异物、民间用药差异、亲缘物种的纹路、颜色等形态学特征相似以及专业经验的缺乏等因素，常有鳖甲伪品和掺伪品混入市场，如佛罗里达鳖，其繁殖力强，生长周期短，产量高，但营养价值和食疗价值低于鳖，药效主治不明确。对用药的安全性和有效性均带来不良影响。目前，鳖甲的鉴别仍然主要依靠传统的性状鉴别技术，即从外观、色泽、质地、气味等方面来评价，其经验依赖性强、准确性较低。此外，部分产品在经过一系列的加工处理后，难以应用形态学考察等常规方法进行有效鉴别。
由于dna存在于大多数生物组织中且非常稳定，检测用量少，因此可以选择鳖甲特有的dna片段作为用于专属性鉴定的识别物。在运用分子标记技术鉴定鳖甲的研究中，现有的技术仅能够应用于鳖甲药材及基原样品，尚无法鉴别饮片及掺伪品，应用范围较为局限。此外，也有研究人员利用基于coi序列的dna条形码技术对鳖及常见混伪品进行分子鉴定，该方法亦仅用于药材及基原，且荧光干扰、碱基错配、生物进化速率等因素使得种内变异阈值难以确定，检验结果的准确性存疑。此外，还有步骤繁琐、时间和成本高等固有缺陷。
pcr具有特异性好、灵敏度高(指数增加)、重复性好、操作简便、高通量(每台仪器单次可扩增96个样品)等优势；然而，在常规pcr技术利用dna序列进行物种的鉴定过程中，由于采用了coi、its等区域的通用引物，因此在完成扩增后，需要进行产物测序并与基因数据库比对，然后才能判断种属，步骤较多、耗时长、需要专门设备；此外，还无法实现对于掺伪品的检识，或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，建立较为完善的鳖甲鉴定体系，即基原、药材、饮片。
本发明针对鳖甲正品以及常见伪品的基原分别设计了特异性引物，并提供了利用特异性引物组扩增技术鉴别鳖甲的方法。该法操作简单、专属性强、鉴别快速、无需测序，能准确、直观地鉴别鳖甲的真伪(包括掺伪)。本发明为鳖甲的专属性鉴定提供一条新的途径，有助于监控鳖甲产品的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。
本发明通过以下步骤达到鉴定鳖甲系列产品的目的：
本发明首先提供一组用于鉴定鳖甲的特异性引物，所述引物为pps-1或pps-2，具体如下所示：
pps-1上下游引物如seq.id.no.1和2所示，分别为：
pps-1-f(seq.id.no.1)：agccctatcagtttgaataccac
pps-1-r(seq.id.no.2)：caaccggaccatataattgagt
pps-2上下游引物如seq.id.no.3和4所示，分别为：
pps-2-f(seq.id.no.3)：atatgactactagccgcact
pps-2-r(seq.id.no.4)：ggcagctaagattattgaccc。
所述的引物pps-1和pps-2均来自于鳖(pelodiscussinensis)，并且能同样的达到鉴定鳖甲的目的。
根据上述引物pps-1或pps-2鉴定，若受试样品为完整的鳖甲且结果显示为阳性，则判断为正品鳖甲，若受试样品经切片或粉碎，为非完整的鳖甲(如碎片、粉末)且结果显示为阳性，需进一步鉴定是否为掺伪品(含佛罗里达鳖)，具体的，所述特异性引物还包括引物paf-2，具体如下所示：
paf-2上下游引物如seq.id.no.7和8所示，分别为：
paf-2-f(seq.id.no.7)：cctatcactacaccccatacaac
paf-2-r(seq.id.no.8)：atgctactaataatgacacccc。
本发明还提供一种特异性鉴定鳖甲的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物pps-1或pps-2引物对、dna阳性对照、pcr扩增体系、电泳检测体系。
进一步的，通过特异性引物pps-1或pps-2鉴定是否为鳖甲或含有鳖甲，所述试剂盒还包上述的特异性引物paf-2引物对，进一步鉴定是否为掺伪品。
所述各引物序列详细信息如下：
本发明还提供一种特异性鉴定鳖甲的方法，首先制备dna供试品溶液，随后利用pcr及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。
其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：
(1)将鳖甲产品粉碎后过40目筛，称取适量细粉加入sds裂解液和蛋白酶k(料液比：50～200:1mg/ml)，涡旋混匀，置恒温混匀仪55℃～65℃提取1h～8h，离心取上清液；
(2)依次将与上清液等体积的tris平衡酚、酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)、三氯甲烷-异戊醇(24:1)分别与上清液混合，离心取上清液；
(3)在上清液中加入上清液体积0.1倍量的5m乙酸钾溶液和上清液体积2倍量的预冷96％乙醇，混合，置-20℃过夜，离心后弃去上清液；
(4)500μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀，离心并弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量te缓冲液溶解，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。
上述特异性引物鉴定鳖甲的方法，检测方法按照下述步骤进行：
(1)配制pcr反应体系，设置扩增程序，进行pcr扩增；
(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像分析系统判定结果。
步骤(1)中所述的pcr反应体系，以25μl为例，包括：1×pcr缓冲液、2.0mmmgcl2、0.2mmdntps、0.1μm～0.4μm引物对、0.625utaqdna聚合酶、模板dna1ng～300ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。pcr扩增程序为：95℃3min；95℃30s，58℃～68℃10s～30s，72℃1min，循环数30～40；72℃5min～7min。
步骤(2)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含eb染料的2％～3％tbe琼脂糖凝胶分离后凝胶成像判定结果，上样量为3μl～10μl。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的制备方法以sds裂解液和蛋白酶k为提取溶剂，用恒温混匀仪，从鳖甲产品中提取dna，然后以酚仿抽提法进行纯化，不仅降低了杂质对后续pcr鉴定的干扰，操作时间短，成本低，而且该方法与柱纯化相比，样品的用量及供试品溶液浓度灵活可变，杂质不易堵塞纯化柱以及避免纯化柱吸附损失，使得方法适用范围更广泛。
(2)本发明的一组特异性引物针对鳖甲及佛罗里达鳖设计，与公开已知的特异性引物相比，能对同一亚目的不同物种进行区分，可以实现掺伪品的鉴定；此外，扩增的目的产物很短(≤120bp)，非常有益于目的片段的扩增，降低模板降解导致扩增假阴性的机率。该鉴定鳖甲的方法与常用的基于coi基因的dna条形码鉴定技术相比，适用范围更广，可适用于鳖甲基原、药材、饮片及其掺伪品。此外，该方法抗干扰能力强、无需进行测序、便捷经济、高通量，能直观而准确地对鳖甲进行鉴定。
(3)与目前现有的基于coi基因的dna条形码技术，采用通用引物lco1490、hco2198对基原样本及自制鳖甲掺伪品(鳖和佛罗里达鳖的掺入比例为1:1)进行鉴定的技术相比较，本发明中的检测方法可直接、简便、高通量地对鳖甲产品进行准确鉴定，无需测序，比基于coi基因的dna条形码研究技术更为直观、经济、快速，且具有适用范围广、抗干扰能力强、可识别掺伪品等特点，为鳖甲产品的真伪快速鉴定提供了一种新的方案。
附图说明
图1是鉴定方法流程图。
图2是特异性引物筛选电泳结果图。
图3是特异性引物优化电泳结果图。
图4是筛选的引物组特异性验证电泳结果图。
图5是本发明的特异性引物检测测序结果与目的片段比对图。
图6是本发明的特异性引物对自制鳖甲掺伪品检测电泳结果图。
图7是本发明的特异性引物pps-2和paf-2对不同批次市售鳖基原样品检测电泳图。
图8是本发明的特异性引物pps-2对不同批次市售鳖甲药材样品检测电泳图。
图9是本发明的特异性引物pps-2对不同批次市售鳖甲饮片检测电泳图。
图10是本发明的特异性引物pps-1对不同批次市售鳖甲饮片检测电泳图。
图中，cr为乌龟基原样品、ts为巴西龟基原样品、ms为花龟基原样品、ps为鳖基原样品、af：佛罗里达鳖基原样品；m：lowladdersn127；p：阳性对照；n：阴性对照。
ps:af为鳖与佛罗里达鳖混合的自制掺伪品；7:1、3:1、1:1、1:3、1:7为五种鳖与佛罗里达鳖不同的掺伪比例。
ps1～10为10批鳖基原样品，af1～2为2批佛罗里达鳖基原样品，yb1～10为10批鳖甲药材，sb1～10为10批鳖甲饮片。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式和附图对本发明进行进一步的阐述。
本发明实施例中涉及到的样品材料均来自市售。所涉及的简写及名称如下：
cr4：乌龟基原样品，来自江苏无锡；ts1：巴西龟基原样品，来自江苏镇江；ms1：花龟基原样品，来自浙江杭州；ps1：鳖基原样品，来自江苏无锡；af1：佛罗里达鳖基原样品，来自江苏苏州。
cr为乌龟基原样品，其中，1来自浙江湖州，4来自江苏无锡。
ts为巴西龟基原样品，其中，1来自江苏镇江，2来自江苏无锡。
ms为花龟基原样品，其中，1来自浙江杭州，2来自江苏无锡。
ps为鳖基原样品，其中，1来自江苏无锡，4来自江苏泰州。
af为佛罗里达鳖基原样品，其中，1、2均来自江苏苏州。
ps1～10为10批鳖基原样品，其中，1来自江苏无锡，2、3来自江苏盐城不同市场，4、5来自江苏泰州不同市场，6、7来自河南南阳不同市场，9来自四川简阳，10来自江苏镇江；af1～2为2批佛罗里达鳖基原样品，均来自江苏苏州。
yb1～10为10批鳖甲药材，其中，1～3购自安徽亳州久铭堂药业，4～5购自安徽亳州宁云堂药业，6～10购自河北保定祁州堂中药材。
sb1～10为10批鳖甲饮片，均购自亳州市佰世信中药饮片有限公司。
实施例1：鳖甲试剂盒特异性引物的设计、筛选、优化及其验证
(1)试剂
十二烷基硫酸钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、蛋白酶k(20mg/ml，sigma-aldrich，p6556)、tris平衡酚(
(2)方法
首先设计特异性引物：
根据鳖pelodiscussinensis(accessionno.：nc_006132.1、ay687385.1、ay962573.1)及佛罗里达鳖apaloneferox(accessionno.：nc_014054.1、fj890514.1)的基因差异，设计特异性引物，并根据需求修改，如seq.id.no.1-8所示，由上海生工有限公司合成。
其次筛选特异性引物：
将鳖甲基原样品(包括鳖甲及其常见伪品)粉碎，称取40目以下粉末50mg，加入995μl的sds裂解液和5μl蛋白酶k，涡旋混匀，56℃下于恒温混匀仪(拓普森科学仪器有限公司)600rpm提取6h，离心取上清液；依次将与上清液等体积的tris平衡酚、酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)、三氯甲烷-异戊醇(24:1)分别与上清液混合，离心取上清液；在上清液中加入上清液体积0.1倍量的5m乙酸钾溶液和上清液体积2倍量的预冷96％乙醇，混合，置-20℃过夜，离心后弃去上清液；加入500μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；室温晾干或冻干，以适量te缓冲液溶解，得到基因组dna供试品溶液，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。
配制pcr反应体系：1×pcr缓冲液，2.0mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps，0.2μmol/l引物对，0.625utaqdna聚合酶，模板dna50ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。离心后，置于pcr仪(5331thermalcycler，eppendorf)进行扩增，反应条件：95℃3min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。8μl扩增产物采用含eb的2％琼脂糖凝胶进行分析。电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据各电泳条带的有无及亮度、分子量大小以筛选特异性引物。
结果如图2所示，各特异性引物对其相应物种进行扩增分析结果均有明亮的条带，其分子量与预期扩增的目的片段长度相一致。其中，pps-1、pps-2两引物对乌龟物种有非常微弱的非特异性扩增，对其余四个物种的特异性均非常好；佛罗里达鳖的两对引物中paf-2除对鳖有非常微弱的非特异性扩增外，对其余四个物种的特异性均非常好。通过各扩增参数的优化均有望用于鳖甲样品的真伪鉴定。但paf-1未扩增出相应的条带，调节各项参数均无法实现扩增，故将该引物筛除。
优化特异性引物：
根据特异性引物的筛选结果，以引物pps-2、paf-2为例。通过引物浓度、退火温度等参数对筛选的特异性引物进行优化。
如图3所示表明，在35个循环扩增反应下，pps-2和paf-2引物均在退火温度为66℃时，扩增效果最佳，pps-2和paf-2引物在扩增条件为95℃3min；95℃30s，66℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min时扩增效果较好。
验证特异性引物：
随机抽取已鉴定的鳖及常见伪品的基原样品的甲壳各2批在优化的条件下进行pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳分析及凝胶成像系统检测，根据电泳条带的有无以及分子量大小以对特异性引物进行验证。此外，通过纯化后的扩增产物进行进一步的双向测序确认是否为目的片段。
结果如图4所示，特异性引物通过不同批次鳖及其常见掺伪品在优化的条件下进行特异性验证，鳖的dna通过特异性引物进行扩增后在120bp处产生条带；其常见混伪品(来源于佛罗里达鳖)则与其特异性引物进行扩增后，在114bp处产生条带，且引物间无交叉反应，体现出了很强的专属性。此外，测序比对结果如图5，测序结果与目的产物序列基本一致，表明所获得的扩增产物确实为预期扩增的目的片段。
实施例2：鳖甲试剂盒检测方法
将鳖甲产品粉碎，称取40目以下粉末50～200mg，加入995μl的sds裂解液和5μl蛋白酶k，涡旋混匀，置恒温混匀仪55℃～65℃提取1～8h，离心取上清液；依次将与上清液等体积的tris平衡酚、酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)、三氯甲烷-异戊醇(24:1)分别与上清液混合，离心取上清液；在上清液中加入上清液体积0.1倍量的5m乙酸钾溶液和上清液体积2倍量的预冷96％乙醇，混合，置-20℃过夜，离心后弃去上清液；加入预冷的70％乙醇500μl洗涤沉淀，离心后弃去上清液；室温晾干或冻干，用25μlte缓冲液溶解，得到基因组dna供试品溶液，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。
准备好dna供试品溶液后进行检测，通过pcr的方法进行：
pcr反应体系：1×pcr缓冲液，2.0mmmgcl2，0.2mmdntps，0.1μm～0.4μm引物对、0.625utaqdna聚合酶、模板dna供试品溶液1～300ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。
pcr扩增程序为：95℃3min；95℃30s，58℃～68℃10s～30s，72℃1min，循环数30～40；72℃5min～7min。
扩增产物采用含eb染料的2％～3％tbe琼脂糖凝胶分离后凝胶成像判定结果，上样量为3～10μl。
实施例3：鳖甲试剂盒对自制掺伪品的检测应用
按照实施例2的方法进行检测：
pcr程序为：95℃3min；95℃30s，66℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。
用预先粉碎的鳖及佛罗里达鳖基原的甲壳粉末按5种不同的比例(7:1、3:1、1:1、1:3、1:7)混合制备鳖甲掺伪品，每个样品的终质量为50mg。然后通过sds法进行提取纯化，并在优化的条件下进行分析。
配制引物的预制反应体系，包括：1×pcr缓冲液，2.0mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps，引物对，0.625utaqdna聚合酶，并加灭菌双蒸水补足至25μl；然后，置入无菌的ep管中，分别加入1μldna供试液，混匀，即得反应体系。此后，将反应体系置pcr仪按上述pcr扩增程序进行扩增。随后，扩增产物采用2％琼脂糖凝胶进行分析，制胶及电泳的缓冲液为tbe，荧光染料eb直接加入胶内，上样量为8μl；电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定鳖甲的真伪。
如图6所示，5种不同比例的进行混合的鳖甲掺伪品由相应物种的特异性引物pps-2、paf-2扩增分析，其条带位置与预期扩增的目的片段长度相一致，表明特异性引物能鉴定出掺伪品中的相应物种。此外，pps-1扩增分析后亦能鉴定出掺伪品中的相应物种。
实施例4：不同批次市售鳖甲样品的检测
按照实施例2的方法进行检测：
将不同批次市售鳖甲样品(基原、药材及饮片)粉碎，称取40目以下粉末50mg，通过sds法进行提取纯化及质量检查。此后，配制pcr反应体系，将其置pcr仪按上述优化的条件进行扩增。随后，将8μl扩增产物采用含eb的2％琼脂糖凝胶及tbe缓冲液进行分析，电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定龟甲的真伪。此外，鳖及佛罗里达鳖的阳性对照物质通过分别称取40目以下基原样品粉末50mg，通过sds法进行提取纯化及质量检查后，冻干制备dna阳性对照物质，并注明其中dna的含量。
结果如图7～9所示，12批鳖甲基原样品、10批鳖甲药材及10批鳖甲饮片的dna通过鳖甲试剂盒引物检测后，有2批鳖甲样品与paf-2引物反应在114bp处产生条带，故鉴定该2批鳖甲样品来源于佛罗里达鳖，为伪品。此外，有30批鳖甲样品与pps-2引物反应在120bp处产生条带，故鉴定该30批鳖甲样品来源于鳖，此时，除饮片外均鉴定为正品，由于饮片为多个样品混合物，需通过paf-2验证是否为掺伪品。检测发现该10批鳖甲饮片均无阳性反应，结果表明亦为正品鳖甲产品。此外，如图10所示，通过pps-1对鳖甲饮片扩增分析，发现结果与pps-2的扩增结果相一致，表明亦能用于鳖甲产品的鉴定。
序列表
<110>江苏大学
<120>一组鉴定鳖甲的特异性引物及其鉴定方法
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>鳖(pelodiscussinensis)
<400>1
agccctatcagtttgaataccac23
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>鳖(pelodiscussinensis)
<400>2
caaccggaccatataattgagt22
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>鳖(pelodiscussinensis)
<400>3
atatgactactagccgcact20
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>鳖(pelodiscussinensis)
<400>4
ggcagctaagattattgaccc21
<210>7
<211>22
<212>dna
<213>佛罗里达鳖(apaloneferox)
<400>7
attagccacactacacggagga22
<210>8
<211>22
<212>dna
<213>佛罗里达鳖(apaloneferox)
<400>8
ttaagcctccaatggttccgaa22
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>佛罗里达鳖(apaloneferox)
<400>5
cctatcactacaccccatacaac23
<210>6
<211>22
<212>dna
<213>佛罗里达鳖(apaloneferox)
<400>6
atgctactaataatgacacccc22