RNA结合蛋白Rbm24基因在心肌病和心律失常中的应用的制作方法

文档序号:18145645发布日期:2019-07-10 11:47阅读:612来源:国知局
RNA结合蛋白Rbm24基因在心肌病和心律失常中的应用的制作方法

本发明涉及基因的功能与应用,尤其是涉及rna结合蛋白rbm24(rnabindingmotifprotein24)基因在心肌病和心律失常中的应用,具体是rbm24在诊断、预防、缓解和/或治疗心肌病和心律失常中的应用。



背景技术:

遗传性心肌病是各年龄阶段心脏病的主要原因之一,病人通常在青少年或成年早期发病。从临床诊断角度,遗传性心肌病分为肥厚型心肌病、扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,dcm)、限制性心肌病和其它类型心肌病[1]。其中dcm是临床诊断中最常见的心肌病,是继冠心病和高血压之后心力衰竭的第三位原因,其5年病死率为15%~50%[2],最终的治疗方法是进行心脏移植,给社会和家庭带来严重负担。

dcm是以心肌坏死,纤维化为主要病理特征,心室内腔扩大,继以心室收缩功能减退为主要特征的心肌疾病。临床常表现为进行性充血性心力衰竭、心律失常、血栓栓塞甚至猝死。研究发现,有相当部分的dcm患者有家族聚集现象。对dcm病人的一级亲属进行详细病史采集与检查常能发现新的dcm病人,家族性dcm发生率远远高于以前所估计的数值,据报道,临床上约有近25%~35%dcm患者是由遗传因素所致[2],提示遗传性因素在dcm发生中起着重要作用。至今已发现超过30个基因与dcm相关,其中基因大部分编码心肌细胞骨架和心肌收缩蛋白,例如titin、tnnt2、myh6、myh7等[1,3](图1)。dcm的病因和发病机制尚未明确。

心律失常(arrhythmia)是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外,激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导,即心脏活动的起源和(或)传导障碍导致心脏搏动的频率和(或)节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病,亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势及是否导致严重血流动力障碍有关,可突然发作而致猝死,亦可持续累及心脏而致其衰竭。后天获得性心律失常可见于各种器质性心脏病,其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病),心肌病,心肌炎和风湿性心脏病(简称风心病)为多见,尤其在发生心力衰竭或急性心肌梗死时。

近年来的研究发现,rna结合蛋白(rna-bindingproteins,rbps)家族对心脏功能有重要的调控作用[4]。rna结合蛋白家族在对基因表达模式进行转录后(post-transcription)调节的过程中发挥重要作用,rbps家族基因与遗传性疾病的作用关系是目前研究的热点,最近研究发现rbm20是新的dcm的致病基因[5,6],调节肌联蛋白(titin)的剪切(splicing)。rbm20突变的大鼠心室扩大,心律失常,猝死率增加,并伴随泛纤维化与人类的心肌病表型相似。此项研究提示了功能不同的基因家族在人类心肌病的作用,寻找新的dcm发生的相关基因[1],将有助于深入理解dcm的发生的致病机制和调控规律,了解心脏功能和衰竭背后的分子学机制,发现dcm更有效的分子学诊断方法,并为心肌病的患者来设计新的治疗策略。我们团队之前通过转录谱技术分析人胚胎干细胞(hesc)分化的心肌细胞,发现一种rna结合蛋白rbm24(rnabindingmotifprotein24,rbm24)富集在hesc来源的纯化心肌细胞中。申请人进一步在斑马鱼模型中对该基因的功能特征进行分析,首次阐明了rbm24在心脏早期发育中的重要作用。我们近期的研究结果表明rbm24对维持一系列心脏相关基因的表达和正常心脏功能是必需的,对心脏细胞肌丝形成及维持心脏节律性收缩是不可或缺的。

参考文献:

[1]olivotto,i.,etal.,definingphenotypesanddiseaseprogressioninsarcomericcardiomyopathies:contemporaryroleofclinicalinvestigations.cardiovascularresearch,2015.105(4):p.409-423.

[2]hershberger,r.e.,a.morales,andj.d.siegfried,clinicalandgeneticissuesindilatedcardiomyopathy:areviewforgeneticsprofessionals.geneticsinmedicine,2010.12(11):p.655-667.

[3]kamisago,m.,etal.,mutationsinsarcomereproteingenesasacauseofdilatedcardiomyopathy.newenglandjournalofmedicine,2000.343(23):p.1688-1696.

[4]lee,m.h.andschedl,t.,rna-bindingproteins.wormbook,2006:p.1-13.

[5]beraldi,r.,etal.,rbm20-deficientcardiogenesisrevealsearlydisruptionofrnaprocessingandsarcomereremodelingestablishingadevelopmentaletiologyfordilatedcardiomyopathy.humanmoleculargenetics,2014.23(14):p.3779-3791.

[6]guo,w.,etal.,rbm20,ageneforhereditarycardiomyopathy,regulatestitinsplicing.naturemedicine,2012.18(5):p.766-u162.

[7]poon,k.l.,etal.rna-bindingproteinrbm24isrequiredforsarcomereassemblyandheartcontractility.cardiovascres,2012.94:p.418-427.

[8]xu,x.q.,etal.globalexpressionprofileofhighlyenrichedcardiomyocytesderivedfromhumanembryonicstemcells.stemcells,2009.27:p.2163-2174.



技术实现要素:

本发明的目的在于提供rna结合蛋白rbm24(rnabindingmotifprotein24)基因在心肌病和心律失常中的应用。

rbm24基因表达的试剂在制备心肌病和心律失常辅助诊断或预后产品中的应用;rbm24基因或rbm24基因所编码的rbm24蛋白及其下游靶基因在心肌病或心律失常药物中的应用。

所述rbm24基因表达试剂包括检测rbm24基因mrna表达水平的试剂,和/或检测rbm24蛋白表达水平的试剂。

所述rbm24基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物,和/或探针。

所述检测rbm24蛋白表达水平的试剂,包括针对rbm24蛋白的抗体。

所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、针对位点的特异性抗体。

所述rbm24基因用于心肌病和心律失常辅助诊断或预后产品中的应用,所述产品包括权利要求1所述检测rbm24基因表达的试剂。

所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。

所述rbm24基因或rbm24基因所编码的rbm24蛋白及其下游靶基因在心肌病或心律失常的应用,所述药物靶向rbm24基因。

所述药物靶向rbm24蛋白。

所述药物靶向rbm24蛋白的活性。

所述药物靶向rbm24基因的下游靶基因,如mfn2,slc25a3,abcc9,tpm2,titin,nebl,fhod3,enah,obscn,map4,lmo7,tpm1,atp5c,actn2,tnnt2,myh6,myh7,ldb3,pdlim3,ankrd1,nrap,myl3。

本发明的目的通过下述技术方案实现:采用条件敲除小鼠模型(knockout,ko)研究rbm24在出生后个体心脏中的作用。通过建立了rbm24-loxp转基因小鼠,与使用雌激素他莫昔酚(tamoxifen)诱导性的cre-ert小鼠交配,可以在出生不同阶段诱导产生rbm24特异性敲除小鼠,研究rbm24基因敲除对出生后成体心脏结构和功能的影响。发现诱导rbm24敲除两周后,与正常小鼠心脏对比,rbm24敲除小鼠的射血分数下降,心室壁变薄,心室腔变大,表现出扩张型心肌病的形态学变化;rbm24敲除小鼠心电图表现出qrs波变宽,传导阻滞,表明rbm24的基因缺失导致了dcm和心律失常,rt-pcr结果还证明rbm24调控了titin等下游基因的表达,为诊断、预防、缓解和/或治疗心肌病和心律失常提供新的方法。

附图说明

图1为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的rbm24蛋白鉴定。

图2为野生型和rbm24敲除小鼠的心脏形态比较。

图3为野生小鼠心脏超声图。

图4为rbm24敲除小鼠的心脏超声图。

图5为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的心率。

图6为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的舒张期室间隔厚度。

图7为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的收缩期室间隔厚度。

图8为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的舒张期左室内径。

图9为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的收缩期左室内径。

图10为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的收缩期左室后壁厚度。

图11为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的舒张期左室后壁厚度。

图12为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的射血分数。

图13为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的收缩期左室容积。

图14为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的舒张期左室容积。

图15为野生小鼠的心电图。

图16为rbm24敲除小鼠的心电图。

图17为野生小鼠和rbm24敲除小鼠的titin表达。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。

1、rbm24基因诱导性条件敲除小鼠获得和鉴定

建立tamoxifen诱导下的敲除rbm24基因小鼠模型,并与cre-ert小鼠交配,获得条件敲除性小鼠f1,进而回交获得f2纯合子,tamoxifen(1mg/day腹膜注射,连续注射5d)诱导敲除,western-blot检测rbm24基因敲除小鼠中rbm24蛋白的表达(图1)。

2、对rbm24条件敲除小鼠进行表型分析:

1)解剖观察rbm24基因敲除后小鼠心脏的形态,如图2所示,和正常小鼠相比,rbm24敲除小鼠的心室壁变薄,心腔扩大。

2)超声分析心功能的变化:小鼠分别经腹腔注射麻醉或口鼻吸入气体麻醉,待其后肢反射消失后,仰卧位固定于39℃恒温生理信息监测台上,四肢涂抹少量耦合剂后分别固定于金属探测片上,左胸前脱毛后进行经胸壁超声探测,拍摄小鼠心脏超声图(图3和4)。m-mode超声心动图探头置于小鼠左侧胸前,向小鼠右肩旋转30-45°,在乳头肌最大切面应用m-mode超声记录左心室运动情况,记录心率(图5),测量舒张期室间隔厚度(图6),收缩期室间隔厚度(图7),左室舒张末内径(图8),左室收缩末内径(图9),舒张期左室前壁厚度(图10)和舒张期左室后壁厚度(图11);每只小鼠做6次测量,取6个心动周期的平均值。然后计算左室射血分数(图12),左室舒张末容积(图13),左室收缩末容积(图14),等。结果显示,rbm24敲除小鼠的射血分数下降,心室壁变薄,心室腔变大。

3)检测小鼠心电的变化选择洁净、室内温度比较恒定、无噪音的实验室。连通心电图机电源,打开机器预热5min,调好基线,待稳定后将正常小鼠用1%戊巴比妥钠,进行腹腔麻醉。待小鼠安静后,取小鼠仰卧位,电极连线分为红色(r)右上肢,黄色(i)左上肢,黑色(rf)右下肢,绿色(lf)左下肢,将针电极分别刺入其四肢皮下,记录小鼠心电图和心率。结果表明(图15和16),rbm24基因敲除小鼠心电图中qrs波变宽,传导阻滞。

4)rbm24调控的下游靶基因。将rbm24敲除小鼠和正常小鼠麻醉处死后,摘取心脏,用rt-pcr的方法检测,发现其下游靶基因表达发生了明显改变(基因见受rbm24基因调控的下游靶基因列表),例如rbm24敲除后,titin基因两个转录本(n2ba和n2b)中n2ba的表达变少(图17)。

以下给出dna碱基序列:

以下给出蛋白质氨基酸序列:

受rbm24基因调控的下游靶基因列表参见表1。

表1

本发明公开一种rna结合蛋白rbm24(rnabindingmotifprotein24)基因在心肌病和心律失常中的应用,属于基因的功能与应用领域。经研究结果显示,rbm24基因与心肌病和心律失常密切相关。rbm24基因特异性敲除后,小鼠的心室腔明显扩大,表现出扩张型心肌病的功能性、病理性变化和心律不齐,表明rbm24的基因缺失导致了心肌病和心律失常的产生。本发明表明rbm24基因可以作为诊断和治疗心肌病及心律失常的新靶点。

序列表

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<120>rna结合蛋白rbm24基因在心肌病和心律失常中的应用

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